[发明专利]制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明与皿培式牛樟芝(Antrodia cinnamomea)中活性成分有关，更详而言之是指一种制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法者。

背景技术

牛樟芝子实体所含的多种化合物、三萜类活性成分，已被不少研究证实具有抗肿瘤、抑制癌细胞生长的功效，如刊登在“活体外毒理学(Toxicology in Vitro)”期刊的马偕一号(MMH01)(“去氢硫色多孔菌酸化合物(dehydrosulphurenic acid)”)，及登载在“国际老人医学期刊(International Journal of Gerontology)”的马偕二号(MMH02)(羊毛甾烷(Lanostane)三萜类成分)等，而已知生产牛樟芝的技术中，利用皿培方式生产牛樟芝，不仅生长速度快，且萃取物的抗癌效果更得到提升，并可减少牛樟树被砍伐、加强民众的环保意识。

已知关于牛樟芝抗癌成分、化合物制备的专利甚多，例如，中国专利CN 102232944B、CN 102000047B、CN 102232945B、CN 102232940B、CN 102232943B、CN 102232942B、CN 102232941B、CN 102443613、CN 104177240A，及美国专利US8546366等，已揭露牛樟芝萃取物中的化合物可抑制癌细胞生长。

其次，已知自牛樟芝中萃取三萜类化合物成分的专利亦不少，例如，中国专利CN 102614195A与美国公开第2010/0210869A1号公开案，以乙醇溶液、正己烷溶液或乙酸乙酯溶液，依次对牛樟芝子实体进行麦角甾醇(Ergosterol)与羊毛甾醇(Lanosterol)三萜类成分的萃取。美国专利US7994158B2以水或有机溶剂(如醋酸、乙酸乙酯、苯、醇类、二氯甲烷等)对牛樟芝进行萃取，得到的水或有机溶剂萃取物，再经硅胶、Sephadex吸收、浓缩和纯化。中国发明公开CN 101555436与中华民国发明第I487531号专利，利用溶剂(乙醇)混合于超临界CO₂，再通入置放有固态牛樟芝的萃取槽中进行萃取，不是萃取过程没有达成稳定状态，牛樟芝的机能成分会不稳定地被萃取出来，即是采固液分离且批式的萃取方式，无法纯化其机能成分、生产成本高。

由上可知，已知牛樟芝三萜类活性成分的萃取方法，大多是利用有机溶剂萃取后再进行浓缩、分离与纯化，制作过程冗长繁复，且有机溶剂易残留，造成毒害与安全性疑虑，而已知超临界流体萃取是将溶剂与CO₂直接混合后进入 进行萃取，需要大量的测试及工作经验，且需经过纯化步骤。

发明内容

本发明的主要目的即在提供一种制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其在超临界状态下，以最少量的乙醇溶剂与超临界二氧化碳流体即可达到平衡，并有最大的分离效果，可达到萃取与分离出三萜类化合物活性成分的功效，且通过多种细胞检测技术，证实所制备的三萜类化合物活性成分确实具有抗癌效果，实为安全、环保与节能的有效方式。

于是，为达成前述的目的，本发明提供一种制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其步骤至少包含有：备取牛樟芝：将1-2Kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽内；萃取与分离：在操作压力2000-4000psi、温度40-60℃的操作条件下，将超临界状态溶剂以3-9L/hr流速通入该萃取槽进行萃取，超临界状态溶剂为超临界CO₂流体与乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的体积比例混合至饱和状态，萃取30-60分钟后，将牛樟芝萃取物通入一层析管柱，利用该层析管柱将牛樟芝萃取物分离出杂质与三萜类化合物，杂质可自该层析管柱的底部去除，另自该层析管柱的顶部取出高浓度三萜类化合物；检测：通过细胞毒性试验、细胞形态变化分析、细胞周期、细胞凋亡检测及细胞爬行转移分析，检测三萜类化合物的抗癌效果。

更进一步地，检测的步骤中，细胞毒性试验的方式，为将大肠癌细胞株放置于一96孔培养盘(10,000cells/well)内200μL的完全培养基(McCoy’s 5a)中，预定时间后将培养基置换成含三萜类化合物0.25-1.0mg/mL的完全培养基，并加入到96孔培养盘的不同孔中；另外，对照组则只加入200μL的完全培养基，培养预定时间后，以四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)