[发明专利]利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产戊二胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法。

背景技术

1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，与二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体—1,5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。

全细胞催化法以赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱羧酶催化产生1,5-戊二胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的1,5-戊二胺生物催化的生产方法，不但可以开发新型生物基材料市场，还可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。

在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，通常在宿主菌中过表达源于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因cadA，构建得到能够催化生产1,5-戊二胺的菌体细胞。酶学活性测定发现cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶的最适催化pH为5.5，当pH大于5.5时，赖氨酸脱羧酶的活性随着pH升高而降低(Biochemistry,1974,13:662-670；Microbiology,1998,144:751-760；The EMBO Journal,2011,30:931–944)。然而，在赖氨酸全细胞催化生成1,5-戊二胺的过程中，催化液pH持续上升，理论上会导致赖氨酸脱羧酶活性降低，从而降低催化合成1,5-戊二胺的效率。为了控制全细胞催化体系的pH维持在较低水平，通常使用高浓度缓冲液，或着在催化过程中实时补加酸性pH调节剂。酸性pH调节剂通常为无机酸(如盐酸和硫酸)或有机酸(如丁二酸、己二酸和癸二酸等)，如此在催化液中形成相应的戊二胺盐，如戊二胺盐酸盐、戊二胺硫酸盐、戊二胺丁二酸盐、戊二胺己二酸盐等。

在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，日本味之素公司率先开 发了使用过表达赖氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌全细胞催化生产戊二胺的方法(美国专利US7189543、欧洲专利EP1482055)。该方法在50L发酵罐中，使用己二酸、丁二酸或癸二酸调节催化体系的pH维持在6.0或6.5，全细胞催化生产戊二胺。类似的，日本三井化学株式会社使用盐酸调节催化反应液的pH维持在6.0(国际专利PCT/JP2011/054388，中国专利CN102782146)，或使用己二酸调节催化反应液的pH维持在6.5(国际专利PCT/JP2008/050265，中国专利CN10158256)，使全细胞催化生产戊二胺的反应顺利进行。国内技术使用6mol/L的HCl在线调节戊二胺催化反应液的pH维持在5.5，催化32小时可得到60.54g/L戊二胺(中国专利CN103725724)。PCT/CN2015/082400专利技术则在催化过程中流加硫酸或磷酸调节戊二胺催化液的pH维持在6.5。

此外，赖氨酸通过赖氨酸脱羧酶催化生成1,5-戊二胺，并同时产生二氧化碳。在全细胞催化生产1,5-戊二胺的过程中，通入空气有利于二氧化碳排出全细胞催化体系，降低反应液中二氧化碳的浓度，从而减少产物竞争性抑制，有利于催化反应向1,5-戊二胺生成的酶促方向进行。例如，在调控1,5-戊二胺催化液pH的现有技术中，美国专利US7189543和欧洲专利EP1482055以0.1vvm的速率通入空气，中国专利CN10158256则以0.5vvm的速率通入空气，国际专利PCT/CN2015/082400技术以1vvm通气量通入空气。

虽然pH调控和曝气过程在理论上有利于酶促反应向1,5-戊二胺生成的方向进行，但是在实际生产应用中，这两项过程控制步骤将会限制1,5-戊二胺全细胞催化在工业化生产中的应用：pH调控过程消耗大量的酸，将会增加辅料成本；盐酸和硫酸等无机酸腐蚀性强，对设备材质要求高，将会增加设备投资；己二酸和癸二酸等有机酸难溶于水，需要以干粉或配制成浆状膏状物的形式补料，将会增加补料管道的设计难度；曝气过程导致pH上升速率快，将会增加pH调节剂的用量；曝气过程导致部分1,5-戊二胺氧化，将会降低产物纯度；曝气过程的气提作用，使排放的尾气中含有二氧化碳和戊二胺，将会导致空气污染、增加企业的环境治理费用。

发明内容