[发明专利]一种唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于唾液样本的理化检验技术领域，主要涉及唾液中N⁶-羟甲基-腺嘌呤 （HOMe-dA）、N²-羟甲基-鸟嘌呤（HOMe-dG）、N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N²-丙醇- 鸟嘌呤（CdG）、6-羟基-1,N²-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N²-丙醇-2'-鸟嘌呤 （γ-Acr-dG）DNA加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/ MS）测定唾液中6种醛类-DNA加合物的方法。

背景技术

甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛是一类广泛存在于环境基质中的污染物。它们主要产 生于有机物的不完全燃烧，如工业生产、卷烟烟气、机动车尾气和烹饪油烟等。活泼的醛基 不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团，如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧 啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。上述醛类形成的主要DNA加合物包括N⁶-羟甲基-腺嘌呤 （HOMe-dA），N²-甲基-鸟嘌呤（HOMe-dG），N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG），1,N²-丙醇-鸟 嘌呤（CdG），α-Acr-dG和γ-Acr-dG，其中HOMe-dA、HOMe-dG和ethylidene-dG在单核苷酸状 态下不稳定，需要将其在DNA酶水解阶段还原为N⁶-甲基-腺嘌呤（Me-dA）、N²-甲基-鸟嘌呤 （Me-dG）和N²-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）才能被检出。

唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成 可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的靶器官，相关研究表明唾液中DNA的损 伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短， 唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌 物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。

目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有³²P-后标记技术、酶联免 疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中 LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。目前，在唾液 中HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、CdG、α-Acr-dG和γ-Acr-dG的高通量分析方法尚未见 报道。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 技术建立的唾液中6种醛类-DNA加合物（HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、CdG、α-Acr-dG 和γ-Acr-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于唾液中6种醛 类-DNA加合物的同时定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，即HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、 CdG、α-Acr-dG和γ-Acr-dG的测定方法，包括以下具体步骤：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集。

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中， 加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水 溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测 DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50μg/mL。