[发明专利]一种唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法

权利要求书

1.一种唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，即唾液中N⁶-羟甲基-腺嘌呤（HOMe-dA）、 N²-羟甲基-鸟嘌呤（HOMe-dG）、N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N²-丙醇-鸟嘌呤 （CdG）、6-羟基-1,N²-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N²-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr- dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集；

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene净化 液，涡旋振荡，冰浴孵育10min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入 纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液 清洗DNA团块，用超纯水复溶DNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的 含量，对于双链DNA一个吸收单位OD相当于50μg/mL；

c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500μL的10mMTris-HCl/5mMMgCl₂缓 冲液中，加入30mgNaBH₃CN，将N⁶-羟甲基-腺嘌呤（HOMe-dA）、N²-羟甲基-鸟嘌呤（HOMe-dG） 和N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）还原为N⁶-甲基-腺嘌呤（Me-dA）、N²-甲基-鸟嘌呤 （Me-dG）和N²-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）进行检测，加入20μL混合内标；添加30U脱氧核糖核酸 酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育 2h，水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100μL30%甲醇水溶液， 即为样品待测液；

d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的6种醛类-DNA加合物标准工作溶液；

e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注 入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的 比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

2.根据权利要求1所述的唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤c中 所述的混合内标为10ng/mL的[¹³C₁₀¹⁵N₅]Me-dG、[¹⁵N₅]Et-dG、[¹⁵N₅]CdG、[¹⁵N₅]α-Acr-dG、 [¹⁵N₅]γ-Acr-dG和50ng/mL的[¹⁵N₅]Me-dA。

3.根据权利要求1所述的唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤e中 选取了ThermoAcdiv^TMPolarAdvantageIIC18色谱柱，规格4.6×150mm，3μm，流动 相体系选取A：0.01%甲酸甲醇，B：10mM乙酸铵水溶液，梯度洗脱，分析时间为25min，进样 量为5μL。

4.根据权利要求3所述的唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，其特征在于：梯度洗 脱程序：0-2min：25%A，2-17min：35%A，17-25min：25%A；流速为0.38mL/min。

5.根据权利要求1所述的唾液中6种醛类-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤e中 串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20psi，雾化气为70psi，干燥气为75psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10V,碰撞能：9eV，驻留时间：50ms。