[发明专利]一种抗乳腺癌肿瘤转移的纳米抗体研制

说明书

技术领域

本发明属于基因工程、细胞生物学技术领域，具体涉及抗TNFα纳米抗体的酵母表达、纯化、抗原亲和常数、半衰期测定，及其体内外抗肿瘤转移活性实验。用这种方法制备的纳米抗体，具有高的抗原结合能力，可用于人类相关疾病的治疗。

技术背景

目前肿瘤转移是肿瘤研究工作的困境之一，超过90％的癌症患者死于肿瘤转移。肿瘤坏死因子α(TNFα)能够调控多种炎症介质和促血管生成因子的合成，在肿瘤的发生发展中扮演关键的角色。TNFα促肿瘤作用主要包括以下几个方面：(1)低浓度的TNFα促进TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的极化作用，使巨噬细胞转化为M2型肿瘤相关巨噬细胞，促进肿瘤的发生发展。(2)TNFα促进肿瘤耐药性的产生。研究表明，免疫微环境中TNFα可以抵抗靶向MAPK途径的治疗，抑制肿瘤微环境中的TNFα信号通路能够显著提高MAPK抑制剂治疗黑色素瘤的效果。(3)TNFα促进肿瘤的转移。研究表明，通过TNFα-TNFR1信号通路刺激淋巴内皮细胞活性，显著促进肿瘤淋巴管生成，促进肿瘤淋巴转移；通过上调VEGF表达促进肿瘤血管的生成；能够诱发细胞表达巨噬细胞抑制因子和细胞外基质金属蛋白酶，这两种细胞因子以旁分泌的方式刺激巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，增强卵巢癌和乳腺癌细胞系侵袭能力。(4)TNFα诱发肿瘤细胞EMT(内皮-间质细胞转化)。TNFα可以通过Snail或ZEB1/ZEB2途径诱导EMT发生，从而增加肿瘤细胞的侵袭特性，是诱导Snail稳定化和EMT的主要信号。

针对TNFα在肿瘤发生、发展中的作用，TNFα的抗体已用于癌症临床前研究中，应用商品化TNFα抗体及TNFR1/TNFR2受体融合蛋白结合可溶性TNFα(sTNFα)及膜结合型TNFα(tmTNF)，阻断TNFα信号通路从而抑制肿瘤细胞的生长、转移。目前已被FDA批准上市的TNFα拮抗剂有五种，它们是英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗和戈利木单抗，用于自身免疫性疾病如强直性脊椎炎和克罗恩病的治疗。现有的TNFα拮抗剂在肿瘤治疗中治疗效果不显著，主要面临的问题是：与肿瘤细胞标志分子如VEGF，HIF，EGF，TfR的抗体靶向治疗所不同，TNFα在肿瘤内部的靶向性较低。并且与血液性肿瘤相比，实体肿瘤结构相对复杂，肿瘤组织渗透性差、作用时间较短。而已上市的TNFα抗体药物空间结构较大，不利于在肿瘤内部发挥作用。因而提高抗体在肿瘤组织内部的渗透性是一个关键环节。

单域抗体为肿瘤的抗体小型化治疗提供了有力的支持。单域抗体也称为纳米抗体，天然缺失轻链，克隆重链可变区基因，可获得具有单个抗原结合结构域的高亲合性抗体。与具有重链、轻链双可变区的传统的抗体相比位阻效应小，更适用于实体瘤的治疗。纳米抗体靶向结合肿瘤细胞的跨膜蛋白EGFR、HER2、MUC-1和可溶型蛋白HGF，以及多种趋化因子已进行大量研究。纳米抗体本身具有强的稳定性和水溶性、低免疫原性、强抗原识别能力及易于生产等优势，在生物技术和医学方面具有较高的应用价值。多种纳米抗体药物已经进入临床I期和II期研究中。因此，有必要提供有效的针对TNFα的治疗肿瘤转移的小型化抗体蛋白。

发明内容

本发明所述的Anti-TNFα-VHH的重组质粒是通过PCR扩增，克隆到pPICZα质粒构建而成。

本发明将重组质粒电转化到GS115毕赤酵母表达菌株中，通过甲醇诱导表达，经镍柱纯化得到抗TNFα纳米抗蛋白，简写为Anti-TNFα-VHH。

本发明用间接ELISA法测定了Anti-TNFα-VHH的亲和力常数为2.05nM。

本发明证实了Anti-TNFα-VHH对炎症刺激下乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭具有抑制作用。

本发明测定了Anti-TNFα-VHH的药代动力学参数，得到该抗体在血液中的半衰期为2.1小时。

本发明研究了Anti-TNFα-VHH在荷瘤小鼠肿瘤内分布，与人IgG相比，Anti-TNFα-VHH具有更强的肿瘤部位聚集能力。

本发明证实了Anti-TNFα-VHH对小鼠乳腺癌自发转移模型的肿瘤生长及肺转移具有显著抑制作用。

附图说明

图1显示PCR法扩增Anti-TNFα-VHH基因序列。M：DNAMarker；1：Anti-TNFα-VHH基因。

图2显示PCR法鉴定线性化质粒电转化酵母获得阳性菌株。M：DNAMarker；1-5：阳性克隆子酵母基因组整合Anti-TNFα-VHH基因。