[发明专利]高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及唾液检测的技术领域，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法。

背景技术

目前常用的检测唾液中孕酮和睾酮的方法有酶联免疫法、电化学发光免疫法等，这些方法受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺乏统一标准，导致检测结果偏差较大，参考价值较低。

发明内容

本发明的目的是解决现有唾液中孕酮和睾酮检测方法技术中存在的部分问题，提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，包括如下步骤：

采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；

(1)具体色谱条件为：

流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；

流动相B：甲醇，纯度为色谱纯；

色谱柱型号：Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；

采用梯度洗脱的方式，见表1；

流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；

表1流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为6；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2 为50；离子源温度为500℃；同时监测目标物孕酮m/z 315.3→109.1、睾酮 m/z 289.3→109.1、同位素内标d9-孕酮m/z 324.4→100.1；孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；

表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数

。

优选地，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于 2ml离心管中，加入50ng/ml内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以10％甲醇水100μl进行复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。

优选地，所述内标溶液配制：准确称取孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解后配制1mg/ml的储备液；孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的工作液。

优选地，所述萃取液为乙酸乙酯。

优选地，所述氮气吹干温度为40～50℃。

本发明的另一方面通过以下方案实现：

高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：

(1)洗脱液：

洗脱液A：0.05％V/V的甲酸水；

洗脱液B：甲醇，色谱纯；

(2)标准品母液：孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；

配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至 10ml，得1mg/ml的母液；

(3)内标液：d9-孕酮的甲醇溶液；

配制：精确称取10mg d9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得 1mg/ml的母液；用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；

(4)稀释液：

稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；

稀释液2：甲醇；

(5)萃取液：乙酸乙酯；

(6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、 QC(M)、QC(H)，浓度分别为：50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml；

孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的溶液A，取100μl溶液A甲醇稀释至100ml 得25ng/ml的溶液B；

QC(H)：取100μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；

QC(M)：取40μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；