[发明专利]高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法

权利要求书

1.高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；

(1)具体色谱条件为：

流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；

流动相B：甲醇，纯度为色谱纯；

色谱柱型号：Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；

采用梯度洗脱的方式，见表1；

流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；

表1流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为6；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2为50；离子源温度为500℃；同时监测目标物孕酮m/z 315.3→109.1、睾酮m/z 289.3→109.1、同位素内标d9-孕酮m/z 324.4→100.1；孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；

表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数

所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以100μl10％甲醇水复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测；

所述内标溶液配制：称取孕酮同位素内标，甲醇溶解；配制1mg/ml的储备液；以甲醇稀释至50ng/ml即得实验所需内标溶液；

所述萃取液为乙酸乙酯；所述氮气吹干温度为40～50℃。