[发明专利]一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)，又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸代谢的中间产物，目前已被国际医学界认为是一种新的独立治病因子。早在1969年就有学者发现同型半胱氨酸能够影响动脉粥样硬化进程，在医学界受到了广泛关注。随后进行了大量的动物试验、体外试验、临床试验以及流行病学调查。动物试验结果已表明高Hcy能诱导胚胎发生神经管畸形，某些先天性疾病，弱智，慢性肾病，Ⅱ型糖尿病也常伴有同性半胱氨酸代谢异常。越来越多的研究证实体内同型半胱氨酸水平升高与冠脉疾病、心肌梗死、颈动脉内膜厚度等心脑血管疾病密切相关。高同型半胱氨酸血症被认为是心脑血管疾病的独立危险因素之一。发达国家中，已经把Hcy作为临床检测的常规项目，我国今年来也加强了Hcy的临床研究，将其列入国家“863”高科技项目和自然科学基金项目。

目前体内Hcy的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法和免疫法。两种方法的灵敏度和准确度较高，但成本较高，需要特殊的仪器和专业的操作人员且操作复杂，对于常规检测是不切实际的。循环酶法是近几年发展起来的一种生化测试方法，相对于传统检测方法来说，此方法能在全自动生化仪上检测，操作简单且具有较好的灵敏度和精密度，已被市场慢慢接受。目前，循环酶法主要包括两种方法，一种是Hcy与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷，腺苷立即产生氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。然而，这种测定需要使用两种起始底物(同型半胱氨酸和腺苷)和四种酶，使其相对复杂，它还涉及测定腺苷浓度的下降，可能不尽人意。另外一种循环酶法是胱硫醚循环法，Hcy在胱硫醚β-合成酶(CBS)催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚，L-胱硫醚在胱硫醚β-分解酶(CBL)的催化下又生成Hcy、丙酮酸和氨。该循环反应生成的丙酮酸可以用乳酸脱氢酶LDH和NADH检测，NADH转变成NAD的速率与样品中Hcy含量成正比。此法设计上是靠测量Hcy转化为β-胱硫醚时产生的胱硫醚，但是却不能够消除内生胱硫醚，而恰恰很多人，特别是肾脏疾病患者的β-胱硫醚的水平非常高(可高达300umol/L，大部分小于20umol/L)，它测的是同型半胱氨酸和胱硫醚的总和，而不仅仅是Hcy，造成Hcy假阳性的错误结果而给实验室带来巨大的医疗风险。两种循环酶法都只适合自动生化仪上操作。

兴起的生化检查方法除了循环酶法外，还有少数使用能够与同型半胱氨酸反应的酶来检查Hcy的含量。授权专利CN1200105C(格雷厄姆等)介绍了一种来自阴道毛滴虫的高半胱氨酸脱硫酶的序列，以及利用此酶来催化同型半胱氨酸、半胱氨酸、邻乙酰-L-丝氨酸和或甲硫氨酸的方法。专利CN102901720A公布了一种血液同型半胱氨酸的检测方法和试剂盒，利用同型半胱氨酸与酶反应生成H₂S，通过检测H₂S的量来计算血液中同型半胱氨酸的含量。该酶与授权专利CN1200105C使用的酶均来自于阴道毛滴虫。

目前市售的试剂盒中的酶均以溶液形式4℃保存，而酶属于蛋白类生物制品，其生物活性易受到多种环境条件的影响，也会受到运输过程中剪切张力的影响，容易使得酶结构改变，溶解度降低，有蛋白絮状沉淀析出等问题，最终导致酶活下降，而不能准确测试。研究表明，在纯化过程中，几乎所有的同型半胱氨酸酶或甲硫氨酸裂解酶的粗酶液共同存在的问题是酶稳定性差、易失活。例如在进行T.vaginalis粗酶纯化的过程中会因为一个冻融循环损失25％酶活，对没有添加PLP的酶液进行透析则会使酶活损失高达50％。酶的不稳定性导致其保存期较短，市售的酶试剂盒最长保存期为12个月。因此，迫切需要一种更好保存酶的条件，进而延长酶的保存期，减少误差。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测同型半胱氨酸的方法。

本发明的另一个目的是提供一种检测同型半胱氨酸的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的。