[发明专利]一种高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种原核生物表达体系，尤其是一种可高效、低成本地获得重组蛋白的可溶性表达载体。

背景技术

在基因工程药物研究中，由于大肠埃希菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作等优点，但不可避免地也存在着一定的缺点。虽然人们开发出了多种表达体系，以克服大肠埃希菌表达产物中含有内毒素、缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误等不足，但大肠埃希菌表达体系仍然是基因表达的重要工具。

在利用大肠埃希菌高水平表达外源基因，尤其是表达产物富含二硫键时，易于形成包涵体，而经变性/复性后，正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，甚至有些蛋白尤其是高分子量的蛋白基本上不能正确折叠。虽然目前已经开发出多种可促进的外源蛋白正确折叠、提高其产量的表达载体，但由于促进蛋白正确折叠的生物分子，如分子伴侣DnaK、GroEL等，其分子量与某些目的蛋白相近，混入其中，导致所获得蛋白的纯度不高，而且各种促进蛋白正确折叠的生物分子适用不同的目的蛋白。

一般情况下，利用基因重组技术，可以实现低成本、高效地获取具有药用价值的重组多肽或蛋白，但所获得的蛋白纯度不高、纯化步骤繁琐。通常采用亲和标签与目的蛋白融合表达的方式来简化重组蛋白的分离纯化步骤，但所获得的目的蛋白的一端带有亲和标签。而对于很多蛋白质药物而言，药典规定其不能含有亲和标签，故亲和标签的去除又成为了一个难题。目前，常见的亲和标签去除方法有化学法切割和酶法切割。其中，化学法切割对目的蛋白的活性影响较大，酶法切割成本较高，均不适合大规模应用。

综合来看，目前还没有一种载体能够在保证目的蛋白正确折叠的情况下通过自我剪切获得不含任何标签的目的蛋白的低成本、高收率的方法。

发明内容

本发明提供了一种可高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体及其构建方法，利用该载体进行外源蛋白的表达克服了现有技术中存在的外源蛋白表达量少、纯度低、操作步骤多、以包涵体形式表达的缺陷。

本发明解决当前技术问题所采用的技术方案是：

所述的高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白质表达，载体结构中同时含有内含肽基因与硫氧还蛋白基因，且所表达的内含肽与硫氧还蛋白用六聚组氨酸标记。其结构基因，按顺序为六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体编码基因、外源目的基因、核糖体结合位点、硫氧还蛋白-柔性连接肽-六聚组氨酸标签复合体编码基因。

本发明的表达载体通过如下方法构建：分别获取内含肽与硫氧还蛋白的核酸序列，通过设计合适的引物，对两个基因(内含肽和硫氧还蛋白)的核酸序列进行优化和修饰，以市售的通用型表达载体为母核，通过酶切、酶连，获得特征结构序列依次为六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体编码基因、外源目的基因、核糖体结合位点、硫氧还蛋白-六聚组氨酸标签复合体编码基因的重组可溶性表达载体。其中，将六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体命名为I复合体蛋白，硫氧还蛋白-六聚组氨酸标签复合体命名为H复合体蛋白，整个载体命名为pSYPU-IH。

其中，在内含肽基因序列的5'端依次连接上几丁质结合域基因、柔性连接肽基因、六聚组氨酸标签基因。

在硫氧还蛋白基因3'端进行六聚组氨酸基因标记。

所述的外源目的基因的结构中含有二硫键。

所用的限制性核酸内切酶为BspI、BamHI，宿主菌为BL21。

外源目的基因与硫氧还蛋白基因非融合表达。

本发明的有益效果是：①利用结构中含内含肽的I蛋白的高效自我切割能力，简化操作步骤，可获得不带有亲和标签的外源目的蛋白。②利用结构中含硫氧还蛋白的H复合体蛋白与目的蛋白在两个转录单位中非融合表达，促进目的蛋白正确折叠，获得表达量高、有生物活性的目的蛋白，低成本地解决了大肠埃希菌基因工程表达产物易形成包涵体的问题。同时，通过亲和标签介导，实现硫氧还蛋白的柱上结合，避免其混入，提高目的蛋白质的纯度。③应用价值高，可适用于规模化生产。

总体来看，该表达载体是一种能够在保证目的蛋白正确折叠的情况下通过自我剪切获得不含任何标签的目的蛋白的低成本、高收率的良好工具。

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

附图说明

图1为可溶性表达载体pSYPU-IH的构建及特征图谱

图1-1：(his tag)₆-柔性连接肽-CDB-Intein基因获取；