[发明专利]一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方 法。

背景技术

鸡原始生殖干细胞(Primordialgermcells,PGCs)是配子的祖先细胞，起源于X 期胚盘上胚层，随着原条期的形成，由上胚层中心向下胚层迁移，再迁移到生殖新月区，之 后随着鸡胚内血管的发育，进人血管中，并顺着血管分布于胚体的心脏、大血管和头部间充 质中，最后迁移到生殖嵴，与生殖嵴共同组成了未分化的性腺。PGCs具有发育的多潜能性， 在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产、药物筛选、家禽育种等方面具有巨大应用前景。由 于禽类在转基因方面具有独特优势，如产蛋可获得大量重组蛋白、性成熟快以及无盶病毒 感染危险等，鸡PGCs作为转基因载体而备受关注。鸡PGCs应用的关键是如何更便捷、更大量 从鸡胚获得PGCs以及体外培养方法。

在哺乳动物体中PGCs只出现于原肠胚早期。与哺乳动物不同，禽类胚胎中的PGCs 经过由血管向性腺迁移，并最终在性腺中转变为精子和卵子。在鸡胚发育的第3d(15HH)前， 它们迁移到胚外的生殖新月区，然后开始在接下来的48h内从生殖新月通过血液逐渐聚集 到未来的生殖器官中。因此，在禽类中可以从早期胚胎的血液中分离到迁移中的PGCs。根据 PGCs独特的迁移途径，目前主要从下4个部位分离禽类原始生殖细胞：(1)从5-8HH期胚胎生 殖新月区分离；(2)从17HH期胚胎血液中分离；(3)从25HH期生殖腺中分离。分离方法的不同 直接影响分离的效果。目前已有一些PGCs分离的方法，常用的是Ficoll密度梯度离心法和 酶解离法。Ficoll密度梯度离心法虽能获得较高纯度的PGCs，但得到的细胞量较少，直接影 响PGCs后续的培养、研究和应用。酶解离法亦可获得大量的细胞，但会对细胞造成损伤，影 响后期细胞培养。

PGCs的体外培养环境精确而复杂，因此维持其未分化的状态是体外培养技术的关 键。饲养层细胞和多种细胞因子在PGCs体外培养体系中起着至关重要的作用。PGCs培养的 饲养层细胞组要有小鼠胚胎成纤维细胞(STO)、小鼠成纤维细胞(MEF)、鸡胚胎成纤维细胞 (CEF)、大鼠肝细胞(BRL-3A)和性腺基质细胞(SCs)等。饲养层细胞一方面可以促进PGCs的 附着，另一方面可以分泌一些促进细胞增殖、抑制分化的细胞因子。维持PGCs体外存活的必 需生长因子包括干细胞生长因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维生长因子(b FGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)能够增强PGCs的增殖并保持其发育全能性。除饲养层 和细胞因子之外，PGCs培养体系中还需要添加谷氨酰胺、非必需氨基酸、核苷和β-巯基乙醇 等。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞 的方法，提取高效纯净，旨在从17HH期胚胎血液中分离PGCs，为PGCs的体外培养、建系和应 用奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)微量玻璃针采血装置的制备；

(2)14HH鸡胚血液的采集；

(3)采集的14HH鸡胚血液置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体 系中培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(4)将纯化后PGCs重新置入含有完全培养基的BRL-3A饲养层细胞上进行体外培养 扩增；

(5)对体外培养扩增的PGCs进行间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记；

(6)对体外培养扩增的PGCs进行RT-PCR鉴定，鉴定的基因包括Nanog、PouV、SOX2、 DAZL、CVH。

进一步，该微量玻璃针采血装置由1ml微量注射器、r3603软管和微量毛细玻璃管 三部分组成，微量注射器和微量毛细玻璃管由r3603软管相连接，在无菌条件下，将微量毛 细玻璃管在酒精灯外焰上快速拉丝。

进一步，所述微量玻璃针采血装置的制备包括以下步骤：

(1)将熔点毛细管放入试管内，高压灭菌；

(2)在净化工作台中，两手捏住熔点毛细管两端，将熔点毛细管中间部位放入酒精 灯火焰外焰，当看到弯曲熔化现象出现时，快速从火焰上撤离并向两端抽拉熔点毛细管；