[发明专利]一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法

权利要求书

1.一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微量玻璃针采血装置的制备；

(2)14HH鸡胚血液的采集；

(3)采集的14HH鸡胚血液置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中 培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(4)将纯化后PGCs重新置入含有完全培养基的BRL-3A饲养层细胞上进行体外培养扩 增；

(5)对体外培养扩增的PGCs进行间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记；

(6)对体外培养扩增的PGCs进行RT-PCR鉴定，鉴定的基因包括Nanog、PouV、SOX2、 DAZL、CVH。

2.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，该 微量玻璃针采血装置由1ml微量注射器、r3603软管和微量毛细玻璃管三部分组成，微量注 射器和微量毛细玻璃管由r3603软管相连接，在无菌条件下，将微量毛细玻璃管在酒精灯外 焰上快速拉丝。

3.根据权利要求2所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所 述微量玻璃针采血装置的制备包括以下步骤：

(1)将熔点毛细管放入试管内，高压灭菌；

(2)在净化工作台中，两手捏住熔点毛细管两端，将熔点毛细管中间部位放入酒精灯火 焰外焰，当看到弯曲熔化现象出现时，快速从火焰上撤离并向两端抽拉熔点毛细管；

(3)将细丝在中间折断，细针要在4cm左右方可，将微量玻璃针插在海绵薄垫上备用；

(4)在注射器上安装r3603软管，r3603软管插入微量玻璃针备用。

4.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所 述14HH鸡胚血液的采集包括以下步骤：无菌条件下打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中用 眼科镊子夹断胚胎背主动脉，使用上述微量玻璃针采血装置，使用微量玻璃针置于胚胎背 主动脉断口处，利用虹吸作用吸取血液，再向外抽动注射器，抽取剩余的血液。

5.根据权利要求4所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所 述14HH鸡胚胚血的采集包括以下步骤：

(1)新鲜种蛋孵化到14-17HH，酒精棉球消毒蛋壳，无菌条件下平放鸡蛋，小心打开蛋 壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中；

(2)用眼科镊夹断胚体背主动脉，血液会流出至胚体表面；

(3)将连有注射器的微量玻璃针置于血液中，微量玻璃针通过虹吸作用将从血管中涌 出的血液吸入微量玻璃针中，一段时间后向外抽动注射器，抽取剩余的血液；

(4)推动注射器将微量玻璃针中的血液轻轻注射到含PGCs完全培养液的BRL-3A饲养层 中，每枚鸡胚取5-10μl血液置于饲养层中。

6.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所 述BRL-3A细胞饲养层的制备包括以下步骤：

(1)取冻存的BRL-3A细胞迅速置入37℃的水浴锅中，不断摇晃冻存管，使其在1min钟内 融化，加入培养基稀释至4倍左右；

(2)1000rpm离心5min，弃上清。用含10％血清1％双抗的培养基重悬细胞，转移至细胞 培养皿中，37℃，5％CO2，培养箱培养；

(3)选择生长状况良好、80％-90％汇合的细胞，吸出培养液，用PBS洗涤2次加入含丝裂 霉素-C(10μg/mL)的细胞培养液，37℃孵育2h；

(4)去掉培养液，用PBS洗涤4-6次，以彻底去除丝裂霉素-C；

(5)胰酶消化，使细胞变成单细胞悬液。调整细胞密度为5×10⁵个/mL，接种于6孔板中， 置37℃，5％CO2，培养箱中培养，24h后可使用；

(6)观察细胞生长情况，发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞，以保证细胞铺 成单层，能连成一片而没有间隙；

(7)制备好的饲养层放放入培养箱中备用，使用前换为PGCs培养液；一般制备好的饲养 层在5d内使用。