[发明专利]一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒及方法。

背景技术

李痘病毒Plumpoxvirus,PPV是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，则会造成未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，并且使果实品质大幅度下降，而且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。该病毒1915年在保加利亚首次被发现，而后迅速传遍欧洲大多数国家以及地中海、中非、印度和智利，目前美国和加拿大也有其发生的报道。由于该病毒危害性及其严重，因此它已被欧洲植保组织列入了A2类检疫性病原物，其它国家也对其表现出极高度的重视，纷纷加大对其研究的力度并制定了一系列严格的检测和根除措施，防范于未然。目前中国暂未有发现有关该病毒的正式报道，由于目前我国同其他国家种质资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着苗木等繁殖材料的引进而进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒的检验检疫！

目前，我国出入境植物病毒检测所采用的主要技术方法是酶联免疫吸附(ELISA)检测和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。传统的ELISA技术在实际应用过程中存在检测灵敏度低，检测耗时长，容易出现假阳性结果；RT-PCR技术虽然灵敏度高，但是存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，难以实现植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。因此，建立新的快速、简捷、灵敏的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种方法简单，应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于包括：

其中所述PPV1：5’-ACCGAGACCACTACACTCCC-3'；

PPV2:5’-CAGACTACAGCCTCGCCAGA-3’

规格：50次用量，在-20℃下保存。

本发明应用纳米磁珠检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制样：取0.1g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；其中100mL抽提缓冲液由以下组分组成：

2)清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH₂O；

3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

5)裂解：加入50μLddH₂O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，取1μL样品进行RT-PCR；

7)RT－PCR扩增

扩增体系：

反应条件：50℃30min；94℃3min；然后94℃1min，60℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min；

反应结束后取5μL反应产物在用1×TAE缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

如上所述的一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的方法：其特征在于纳米磁珠由以下方法制备：

1)Fe₃O₄磁性纳米粒子制备与氨基化修饰