[发明专利]一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于包括：

其中所述PPV1：5’-ACCGAGACCACTACACTCCC-3'；

PPV2:5’-CAGACTACAGCCTCGCCAGA-3’

规格：50次用量。

2.应用纳米磁珠检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制样：取0.1g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；其中100mL抽提缓冲液由以下组分组成：

2)清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH₂O；

3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

5)裂解：加入50μLddH₂O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，取1μL样品进行RT-PCR；

7)RT－PCR扩增

扩增体系：

反应条件：50℃30min；94℃3min；然后94℃1min，60℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min；

反应结束后取5μL反应产物在用1×TAE缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

3.根据权利要求1所述的一种应用纳米磁珠检测李痘病毒的方法：其特征在于纳米磁珠由以下方法制备：

1)Fe₃O₄磁性纳米粒子制备与氨基化修饰

具体操作为：分别取5.2gFeCl₃·6H₂O、2.7gFeSO₄·7H₂O、0.85mL12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/LNaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌；随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀；反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe₃O₄磁性纳米粒子无水乙醇溶液；取25mLFe₃O₄磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min；滴加0.4mLAPTES，室温下搅拌7h；反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe₃O₄纳米磁珠无水乙醇溶液；

2).免疫纳米磁珠的制备

取0.5mL氨基化Fe₃O₄纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mLPBS清洗3次，磁分离器弃上清液。加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的李痘病毒PPV抗体包被氨基化Fe₃O₄纳米粒子，室温下振荡固定2h；磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用。