[发明专利]高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：

1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；

2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；

3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上pykA基因；

所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中fdh基因的拷贝数；

所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发菌基因组上；

所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组上。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除或整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上的pykA基因替换为FRT；

所述FRT具体为序列14第59-106位；

所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动子的片段2；

所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷酸；

所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷酸；

所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/Cas系统分别敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因序列第74-373位核苷酸、yqeG基因序列第1-695位核苷酸、yagM基因序列第121-855位核苷酸；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的靶基因分别为yieP、stpA、yqeG、yagM基因；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的sgRNA的核苷酸序列分别为序列33、序列34、序列35、序列27；

所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有ter基因及其RBS的片段替换所述目的菌B基因组上yciA基因；

所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列25；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的靶基因为yciA基因；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列为序列28；

所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系统替换目的菌B基因组上poxB基因；

所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列26；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的靶基因为poxB基因；

所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列为序列29。