[发明专利]一种磷酸糖类物质的富集和固相衍生预处理方法

权利要求书

1.一种磷酸糖类物质的富集和固相衍生预处理方法，其特征在于：

（1）预处理材料的制备：在SiO₂表面包覆一层聚多巴胺PD，得到SiO₂@PD微球，再在SiO₂@PD微球表面键合上钛离子，形成金属离子亲和色谱材料SiO₂@PD-Ti⁴⁺；

（2）预处理过程：首先通过金属螯合作用将磷酸糖类物质富集在SiO₂@PD-Ti⁴⁺微球上，接着被富集的磷酸糖类物质和衍生试剂进行固相衍生反应，实现富集和衍生一体化，获得富集和固相衍生后的磷酸糖类物质。

2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：衍生试剂为3-氨基-9-乙基咔唑。

3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：磷酸糖类物质为6-磷酸葡萄糖、核糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸和甘油醛-3-磷酸中的一种或二种以上。

4.根据权利要求1、2或3所述的预处理方法，其特征在于包括以下具体步骤：

第一步 合成金属离子亲和色谱材料SiO₂@PD-Ti⁴⁺：将100-300 mg粒径为3-10 μm 的SiO₂分散在30-50 mL浓度为1-3 mg/mL的多巴胺水溶液中，在磁力搅拌下迅速加入30-50mL pH 为8-9的Tris缓冲液，在水浴温度25-60℃，磁力搅拌条件下反应8-12小时，水洗后得到SiO₂@PD微球；然后将SiO₂@PD分散在60-100 mL浓度为80-120 mM的Ti(SO₄)₂溶液中，在水浴温度25-60℃，磁力搅拌条件下继续反应2-4小时，水洗后得到SiO₂@PD-Ti⁴⁺微球；

第二步 预处理过程：取4-6 mg SiO₂@PD-Ti⁴⁺材料，用上样液平衡材料1-2次，所述上样液由体积比为1:1-2:1的ACN/H₂O溶液加入终浓度为1-3%的甲酸和终质量分数为0.2-1%的谷氨酸配制，再向材料中加入100-300 μL 浓度为8-12 μg/mL的磷酸糖类物质溶液，涡旋振荡2-10 min，离心去除上清液，材料用上样液洗涤2-4次；然后向该材料中加入200-600 μL浓度为20-30 mM 3-氨基-9-乙基咔唑、100-300 μL 浓度为40-60 mM 氰基硼氢化钠和60-100 μL乙酸作为催化剂，在混匀振荡仪上涡旋振荡5-20min，振荡频率为600-1200 rpm/min，温度为50-70℃；衍生反应完后，离心去除上清液，用溶剂体积比为1:1-4:1的CH₃OH/H₂O洗涤材料2-3次，获得富集和固相衍生后的磷酸糖类物质；最后向富集有磷酸糖类物质的材料中加入100-300 μL 3-6% NH₃.H₂O，涡旋振荡2-10 min，离心取上清液。

5.根据权利要求4所述的预处理方法，其特征在于：将权利要求4第二步中通过预处理后得到的含有衍生化后的磷酸糖类物质的上清液进行反相液相色谱-质谱联用分析。

6.根据权利要求4所述的预处理方法，其特征在于：通过金属螯合作用将磷酸糖类物质富集在SiO₂@PD-Ti⁴⁺微球上是于含有磷酸糖类物质的动物细胞7721 Hepatocarcinomacells和Hepatocarcinoma 3b cells中的一种或二种以上的提取液中进行。