[发明专利]一种提取拟南芥种子中总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提取拟南芥种子中总RNA的方法。

背景技术

RNA提取是分子生物学研究领域的基础，高产量，高纯度的RNA样品是后续进行基因 克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。因此，一套高效的RNA提取方法在分子 生物学研究中显得非常重要。

植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提 取比其他生物材料更加困难。富含酚类化合物和多糖类物质，或含有大量次生代谢产物，或 内源RNase含量较高是这些植物RNA提取的主要障碍。很多植物组织含有大量的多酚和多 糖类物质，酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响 RNA的分离纯化。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难 将他们分开。

公告号为CN101638651B的专利文献公开了一种利用异硫氰酸胍-氯仿抽提、Tris饱和 酚纯化植物RNA的抽提方法。改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化 两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫 草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基 肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放 RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第 二步用Tris饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。该方法操 作步骤简单、经济实惠、稳定性好，适用于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提 取高质量总RNA。

拟南芥作为典型的模式植物，从拟南芥中提取纯度高、完成性好的总RNA，有利于其分 子生物学研究的开展。但是拟南芥种子含有大量的脂类、蛋白、多糖多酚等物质，严重影响 了RNA提取的质量和纯度，目前常用的提取方法如Trizol法、苯酚法、异硫氰酸胍酚法、 RNAplantplus以及ReagentKits很难提取拟南芥种子RNA。

公告号为CN102220312B的专利文献公开了一种室温提取花生种子中总RNA的方法， 包括如下步骤：(1)研磨花生未成熟种子，制得花生冻干粉；(2)将花生冻干粉加入Trizol试 剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置， 20～32℃离心，取上清液；(3)加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液； (4)加入异丙醇混合，静置，20～32℃离心，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。该方法离 心步骤在20～32℃完成，且操作时间较原有技术时间短，从而缩短了RNA被降解的时间，重 复性好，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。

已有的报导提取含油脂、多糖、多酚的种子RNA的方法(如SIMONABIRTIC,ILSE KRANNER.,Phytochem.Anal.2006,17:144-148)应用到拟南芥种子的RNA提取中，效果均不 理想，且提取步骤多，提取试剂贵；利用Trizol提取的RNA的快速方法(LingandLewis, Biotechnol.J.,2010,5:183-186)也不能在拟南芥种子中提取高纯度的RNA，提取质量不好。

发明内容

本发明提供了一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，解决了现有技术中提取步骤多、提 取质量不高的问题。

一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，包括以下步骤：

(1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子，得拟南芥种子冻干粉；

(2)将拟南芥种子冻干粉加入到预热的提取缓冲液中，再加入β-巯基乙醇，涡旋混合，离 心，吸取上清液，得第一离心上清液；

(3)第一离心上清液中加入氯仿和水饱和酚，涡旋混匀，18～25℃条件下离心，吸取上清液， 得第二离心上清液；

(4)第二离心上清液中加入氯化锂，静置，离心，得第一离心沉淀；

(5)用DEPC水溶解第一离心沉淀，加乙酸钠和异丙醇，静置，离心，得第二离心沉淀；

(6)将第二离心沉淀经醇洗，干燥，复溶即得所述拟南芥种子总RNA。

所述提取缓冲液的成分为：100mMTris-HCl，10mMEDTA，2％w/v十二烷基硫酸锂， 0.6MNaCl，0.4M柠檬酸三钠。