[发明专利]一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养和基因工程技术领域。涉及适用于三系籼型杂交水稻亲本川香29B成熟胚愈伤组织的农杆菌介导的遗传转化方法。

背景技术

农杆菌介导的遗传转化体系由于操作简单、T-DNA插入到基因组的拷贝数低、可以转化大片段DNA等优点，已成为基因遗传转化的常规手段广泛应用于水稻基因功能研究和分子育种中。水稻的胚性愈伤组织是农杆菌遗传转化的良好受体，其组培特性的好坏将直接决定农杆菌介导水稻遗传转化能否成功。籼稻和粳稻是栽培稻的两个亚种，大多数粳稻品种组培特性较好，愈伤组织诱导容易、增殖速度快、耐继代培养能力强、分化再生率高。许多粳稻品种已经建立成熟的组培体系和遗传转化体系。而栽培面积广的大多数籼稻品种具有不良的组培特性，其表现为愈伤组织诱导率和再生率低，后续继代培养中容易褐化，使得籼稻遗传转化效率低，有的品种甚至难以进行转化，目前，虽然少数籼稻品种已经建立稳定的组织培养体系和转化体系，但由于不同品种籼稻之间组培特性差别较大，不能适用于大多数籼稻品种。高效、广泛适用的籼稻组织培养体系和转化体系尚未建立，特别是在生产上有广泛应用价值的籼稻品种存在组织培养困难、遗传转化效率低等问题，极大地阻碍了籼稻基因功能研究和基因的利用，因此，探索具有重要应用价值的某类或每种籼稻品种最适的培养基和方法，以及遗传转化方法具有重要理论和实践意义，

川香29B是优质籼型香稻保持系，其母本为川香29A具有开花习性好，异交结实率高，抗病性强，米质优良且有香味等特点，利用川香29A已成功配制十多个杂交稻品种或组合。该品种具有许多优良农艺性状，也是水稻重要农艺性状相关基因和香味基因定位研究重要材料，我们系统地研究分析了培养基成分、激素、凝胶种类、碳源种类和浓度对生产上广泛应用的优质籼稻品种川香29B成熟胚愈伤组织培养的影响，探索出的适合于川香29B的植物组织培养基和方法，所获得的愈伤组织质量好、生长快、再生分化效率高(达90％)。在此基础上研究了农杆菌的浓度、乙酰丁酰酮的浓度等因素对遗传转化的影响，转化效率可提高到26％以上，获得了非常理想的结果。

发明内容

本发明的目的是提供了一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其中包括愈伤诱导、继代和分化、遗传转化过程，所诱导愈伤诱导率高、质量好，继代不易褐化，分化效率高，在其他四种生产上广泛应用的籼稻品种(9311、明恢63、中9B，Ⅱ-32B)中适用性也较好，再生率为60-80％之间，遗传转化效率高，可达26％以上。

本发明通过以下技术方案实现。

本发明所述的一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：

1)筛选适合于籼稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分，命名为NML培养基。

大量元素：KNO₃(2.83g/L)；KH₂PO₄(0.4g/L)；MgSO₄·7H₂O(0.185g/L)CaCl₂(0.125g/L)；(NH₄)₂SO₄(0.463g/L)。

微量元素：KI(0.83mg/L)；H₃BO₃(6.2mg/L)；MnSO₄·4H₂O(22.3mg/L)；ZnSO₄·7H₂O(8.6mg/L)；Na₂MoO₄·2H₂O(0.25mg/L)；CuSO₄·5H₂O(0.025mg/L)；CoCl₂·6H₂O(0.025mg/L)。

铁盐：FeSO₄·7H₂O(27.8mg/L)；Na₂-EDTA·2H₂O(37.3mg/L)。

有机成分：烟酸(1.0mg/L)；盐酸吡哆醇(VB₆)(1.0mg/L)；盐酸硫胺素(VB₁)(1.0mg/L)；Glycine(2.0mg/L)；肌醇(100mg/L)。

2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基。