[发明专利]一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法

权利要求书

1.一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其特征是包括以下步骤：

1)筛选适合于籼稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分：

大量元素：KNO₃2.83g/L；KH₂PO₄0.4g/L；MgSO₄·7H₂O0.185g/LCaCl₂0.125g/L；(NH₄)₂SO₄0.463g/L；

微量元素：KI0.83mg/L；H₃BO₃6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O0.025mg/L；

铁盐：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L；Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L；

有机成分：烟酸1.0mg/L；盐酸吡哆醇1.0mg/L；盐酸硫胺素1.0mg/L；Glycine2.0mg/L；肌醇100mg/L；

2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基：

将籼稻成熟种子，去壳后，先用70-75％酒精浸泡1min，然后用0.1％HgCl₂消毒6-8min；无菌水冲洗6次，然后将灭菌的籼稻成熟胚接入到愈伤组织诱导培养基中，在26-28℃，暗环境下培养一个月的时间，诱导愈伤组织；

诱导培养基配方为：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.6g/L；蔗糖30g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.9；

3)愈伤组织继代培养及继代培养基；

将诱导出来的愈伤组织，挑取淡黄色，颗粒或块状的愈伤组织，接种到继代培养基中，在26℃下暗环境培养，继代培养周期为15-20天；

继代培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30.0g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.9；

4)愈伤组织预培养及预培养基：

将上述继代2次的淡黄色颗粒状愈伤组织，接种到预培养基中，在26-28℃暗培养3-5天；

预培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4-5.6；

5)农杆菌浸染籼稻愈伤组织：

将携带双元载体的农杆菌先在YEB固体培养基添加壮观霉素或卡那霉素，上划线培养，挑取单菌落在YEB液体培养基中培养2-3天，收集农杆菌，用农杆菌悬浮培养基悬浮农杆菌至OD600＝0.1-0.2之间，用此浓度农杆菌菌液浸染预培养后的愈伤组织，常温下浸染10-30min；

农杆菌悬浮培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L，pH5.2；

6)农杆菌和愈伤组织共培养：

将浸染后的愈伤组织置于灭菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力晾干60-90min，然后将愈伤组织接入到共培养基中，19-20℃暗环境下培养3天；

共培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4-5.6；

7)抗性愈伤筛选：

将共培养后的愈伤组织先用无菌水冲洗5-6次，最后一次用含400mg/L头孢霉素和250mg/L的羧苄青霉素浸泡10-20min，然后将愈伤置于无菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力晾干90-120min，接入到筛选培养基中，筛选两次，第一次筛选培养基添加8g/L琼脂作为固化剂，培养条件为26-28℃暗培养15-20天；第二次筛选培养基添加3.2g/L的phytagel作为固化剂，培养条件为26-28℃暗培养，直至长出新的愈伤组织；

筛选培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30g/L；适量的载体上抗性标记的筛选试剂；头孢霉素400mg/L；羧苄青霉素250mg/L；琼脂8.0g/L或Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.9；

8)抗性愈伤分化：

将筛选出的抗性愈伤接种到分化培养基中进行植株再生，在26-28℃下，全天24h光照培养，光照强度为2000-3000Lux，一个月后分化出幼苗；

分化培养基配方：NML培养基基础上，添加6-BA3.5mg/L；NAA0.4mg/L；山梨醇15.0g/L；蔗糖20.0g/L；水解酪蛋白0.6g/L；适量的载体上抗性标记的筛选试剂；头孢霉素400mg/L；羧苄青霉素250mg/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH6.0；

9)幼苗生根培养：

在分化获得幼苗，用无菌镊子拔去幼苗新长出的幼根后，移栽到生根培养基中，进行生根培养，26-28℃，全天24h光照培养，光照强度为2000-3000Lux，10-15天后，开盖加入少量水进行炼苗，一个星期后移栽；

生根培养基配方：1/2NML培养基大量元素、微量元素和有机成分；NML铁盐；蔗糖20g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.8。