[发明专利]一种草莓花青素调节基因功能标记

说明书

技术领域

本发明属于果树育种及分子遗传学领域，并提供了一种草莓花青素调节基因功能标记。

背景技术

草莓（Fragaria×ananassaDuch.）是蔷薇科草莓属植物。因其鲜艳或绮丽的色泽、较高的营养价值及鲜美的口感而备受人们的欢迎。目前我国草莓的栽培面积超过200万亩，鲜艳或绮丽的色泽能够提升产品的市场竞争力，直接影响着草莓种植者的经济效益。但是草莓果实颜色在草莓成熟末期才能表现出，极大的延缓了育种进程。因此为了加快草莓果实颜色育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。目前，一些学者已经对草莓果实花青素积累相关基因进行了遗传分析及基因定位。早在1965年，对二倍体森林草莓（Fragariavesca）的研究发现，红果性状是由染色体C位点基因控制，而黄果或白果性状则是由c位点基因控制(BrownandWareing1965)。Williamson等在1995年通过分析黄果森林草莓‘YellowWonder’(YW)和红果森林草莓‘BaronSolemacher’(BS)的杂交后代果色性状时发现c位点与莽草酸脱氢酶位点紧密连锁(Williamsonetal.1995)。随后，Davis和Yu在1997年利用BS和WC6（取自新罕布什尔州的黄果野生草莓）的杂交群体构建了拥有7个连锁群的森林草莓遗传连锁图谱，遗传图谱显示与黄色果色相关的c位点定位在连锁群I底端(DavisandYu1997)。2001年Deng和Davis通过定位CHS，CHI，F3H，DFR和ANS五个结构基因以及调节基因RAN找出了它们与c位点的连锁关系，结果显示c位点基因与F3H基因紧密连锁，推测两者很可能是同一个基因。但是目前有关草莓色泽相关的分子标记比较少，与草莓果实色泽共分离的分子标记尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术中存在的不足，提供一种草莓花青素调节基因功能标记，利用PCR、酶切和电泳技术即可有效地对草莓果实中花青素调节基因进行基因型选择，可在苗期即可区分红色和黄色草莓果实，从而淘汰非目标植株，大大提高了草莓果实颜色育种效率。基于草莓花青素调节基因MYB10在红色和黄色草莓中编码区存在的单核苷酸突变，根据该位点设计了dCAPS功能标记Fv-RY，该功能标记与草莓花青素调节基因共分离。为利用该功能标记进行草莓果实颜色分子辅助选择，加快育种进程奠定了基础。

本发明的目的是这样实现的，其特征是，（1）草莓花青素调节基因的序列分析：

草莓花青素调节基因MYB10在红色和黄色果实中仅仅存在一个单核苷酸差异，该核苷酸位于MYB10基因第一个外显子上第35个核苷酸，在红色果实中为G，而在黄果为C。

（2）草莓花青素调节基因功能标记的方法：

根据上述红色和黄色草莓中编码区第一个外显子区域存在的单核苷酸突变开发了草莓花青素调节基因的功能标记Fv-RY，该功能标记Fv-RY的正反引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TTCGGTGTGAGAAAAGGTGAAT－3＇

下游引物（R）：5＇－CTGTTTAAGCCTGCAAGTACAG－3＇

功能标记经PCR扩增、酶切和电泳后，在红色果实草莓中显示200bp的片段，而在黄色草莓果实中显示180bp的片段。

（3）Fv-RY功能标记的应用方法：

引物序列在筛选红色和黄色草莓果实中的应用，然后分别进行PCR扩增、酶切和琼脂糖凝胶分析。

PCR扩增的体系和反应程序为：

20μlPCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，0.3μlof10mMdNTPs，2.0μlof10×PCRbuffer，1.2μlof25mMMgCl₂，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；

PCR反应程序为：先95℃3min；然后95℃30s，55℃30s，72℃20s，共33个循环；最后72℃5min，4℃保存。

酶切体系、时间和温度为：

20μl酶切体系为：PCR产物5μl，内切酶HinfI0.2μl，内切酶缓冲液2μl，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；酶切反应时间为3小时，温度为37℃。扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。

本发明的有益效果是：