[发明专利]基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法

说明书

技术领域

本发明属于新型核酸提取技术领域，特别涉及一种基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法。

背景技术

核酸作为遗传信息的载体，是生物体内重要的生物信息分子，也是分子生物学研究的主要对象。为了实现核酸功能探索及生理意义相关研究，通常需要对核酸进行分离纯化。因此，核酸提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作之一，广泛应用于。目前，提取DNA基因组主要采用“磁珠法”、“吸附柱法”、“CTAB法”、“SDS法”等去实现生物样品中DNA的提取，这些方法存在操作过程复杂、提取周期长等缺点。而RNA的提取则常采用经典的TRIzol试剂盒提取法，TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。然而，该方法存在处理样品量有限、易污染RNA酶、易降解等缺点。值得注意的是异硫氰酸胍是一种有毒、可致癌的化学试剂，在提取过程中给实验者带来巨大的伤害。因此，开发新型、快速、高保真、生物兼容性的核酸提取方法对于分子生物学及相关学科的发展具有重要意义。

近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料已广泛的运用于生命科学领域。其中，氧化石墨烯更是成为了“明星”纳米材料，并广泛运用于电子学、材料学、诊断学等学科。众所周知，氧化石墨烯能够通过“π-π堆叠”效应实现吸附核酸的目的，该效应启发笔者利用氧化氧化石墨烯特异性的捕捉核酸，从而实现核酸提取的目的。加之，我课题组前期专利(中国专利：201310178816.9)公开了一种基于氧化石墨烯材料的RNA保护方法，该方法揭示了氧化石墨烯具有优异的RNA保护能力，且具有保护效率高、保护时效长的特点。因此，整合氧化石墨烯的RNA保护天赋、石墨烯的网格状结构及吸附核酸的性能，我们开发了一种基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，该方法操作简单、耗时短、且能为RNA提供有效的保护。

发明内容

为了现有核酸提取技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法。本发明采用磁性石墨烯做为纳米载体，利用石墨烯刚性表面的吸附核酸能力，为核酸提供广阔的吸附截面，由此达到捕捉核酸的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，包括如下步骤：

首先，利用氧化石墨烯表面羧基基团做为连接位点，使其和氨基磁珠连接，从而实现磁性石墨烯纳米复合物的合成；随后，采用裂解液配合蛋白酶K的方法，实现细胞的裂解，释放核酸；通过离心去除细胞碎片后，在上清液中加入磁性石墨烯纳米复合物捕捉核酸；最后，经过磁分离清洗提纯后即得到核酸样品。

所述的细胞可来源于动物细胞、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、动物组织、动物血液或植物组织；

所述的细胞在裂解前需要进行前处理；

所述的核酸样品包括DNA和RNA；

所述的核酸样品中加入DNA酶，得到RNA样品；

所述的核酸样品中加入RNA酶，得到DNA样品；

所述的基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，包括以下具体步骤：

1)样品前处理

①动物细胞样品处理

动物细胞细胞膜较薄、刚性弱、容易裂解，样品前处理包含以下步骤：

a.对于游离培养的细胞采用离心收集的方式，使细胞聚集于离心管底部，再用PBS缓冲液清洗两次去除残留的细胞培养液即可得到细胞沉淀。

b.对于贴壁培养的细胞采用消化液消化或细胞刮刀使细胞脱壁、并游离至培养液中，通过离心收集的方式，使细胞聚集于离心管底部，再用PBS缓冲液清洗两次去除残留的细胞培养液即可得到细胞沉淀。

c.向步骤a或b中收集的细胞沉淀中加入Sampleprotector，并浸泡30min，变性细胞中的RNA酶，从而避免细胞在前处理过程中出现降解。

d.去除Sampleprotector，离心收集细胞沉淀，冷冻于-80℃冰箱备用。

②革兰氏阳性菌样品前处理

革兰氏阳性菌细胞壁较厚、刚性强、较难裂解，样品前处理可通过两种方法实现：

a.溶菌酶溶解细胞壁

a)离心收集过液培养的革兰氏阳性菌，去除培养液后，用PBS缓冲液清洗3次。得到菌体沉淀。