[发明专利]一种培养基中菌体浓度的测定方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种复合培养基中测定菌体浓度的改进方法。该方法包括发酵液保温、酶解、TCA萃取、吸光度测定、计算等步骤。本发明改进点主要体现在：该方法通过对发酵液的适当酶解处理，较好避免了从培养基中提取菌体核酸时固体成分中如黄豆粉、花生粉等物料中所含核酸或类似物的干扰，可以较为准确和充分的提取发酵液中菌体的核酸，从而更为真实地反映发酵液中菌体量，从而为更好为发酵生产提供参考和指导，表现出较好地实用价值和推广应用意义。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种测定复合培养基中菌体浓度的改进的方法。

背景技术

菌体浓度的测定是反映微生物生长代谢情况的一项重要指标，需要较为准确的数据才能较好控制各项生产流程。现有工业化微生物发酵过程中，由于经常使用含有大量固休成分的发酵培养基，如黄豆饼粉、花生饼粉等，而这些固体成分与菌体混在一起，使发酵液中菌体浓度的测定成为一个复杂而又困难的问题，长期以来一直悬而未决。

目前大多数抗生素工厂测定发酵液菌体浓度时，一般均是采用装量体积法（细胞堆积容积测量法，离心压缩细胞体积法，The Packed-Cell volume Method）。但实际使用过程中，这种方法受发酵液中固体原料成分的影响较大，而且在菌体生长稳定期使用该方法时，所测菌体浓度值的增加主要是一些脂类及次级代谢产物合成的结果，并不能真正代表菌体浓度的变化。因而装量体积法测得的数值是菌体浓度及固体培养基成分两个变量互相加合的结果，并不能反应真正的菌体浓度。并且，使用该方法测定的数据在整个发酵过程中无明显规律，也无法反映菌体真正的生长规律。

现有菌体浓度测定中，另外一种较为准确和常用的测定方法是测定培养基中菌体所含核酸的浓度，把核酸的量作为衡量菌体浓度的指标，而菌体中核酸的提取主要通过TCA萃取法获得。但实际使用过程中，该方法受培养基成分影响较大。例如，发酵培养基中如果含有不溶性成分如黄豆粉、花生粉等，其可能含有少量核酸或核酸类似物，而这些物质与菌体中的核酸一起被萃取入TCA中，从而给测定带来一定程度的干扰；尤其是当培养基中采用胚芽粉类物质作为营养成分时，其含有高含量的核酸，经常会对测量值造成严重的干扰。因而对该方法尚需进一步地改进，以获得更为准确的菌体浓度数据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进型的测定发酵液中核酸浓度的TCA测定法，从而更为准确的反映菌体浓度数据。

本发明采取的技术方案详述如下。

一种培养基中菌体浓度的测定方法，具体包括以下步骤：

（1）取待测发酵液，将发酵液在45℃~50℃保温20~40min，优选50℃保温30min；所述发酵液保温结束后发酵液粘度下降，流动性较好；

然后在保温结束后的发酵液中加入纤维素酶和果胶酶，混合均匀以对发酵液进行酶解，期间可每隔5min以颠倒混匀；

所述发酵液例如可为金霉素发酵液，具体例如正常发酵0~120h的金霉素发酵液或者培养0~36h的金霉素种子液；

所述纤维素酶和果胶酶的总加入量为发酵液质量的2%~4%；其中纤维素酶（酶活力≥25万U/g）和果胶酶（酶活力≥10万U/g）的质量比为1:1.5~2.0，酶解时温度控制在35℃~50℃，酶解时间≥1h，但不宜超过5h，以避免酶解过长时间从而影响发酵液品质；

（2）将步骤（1）中酶解完成后的发酵液，0℃、3000×g 离心10min，弃上清，保留沉淀物；

（3）向步骤（2）的沉淀物中加入2℃~4℃的5% (V/V)的TCA （三氯乙酸）溶液，充分搅拌洗涤沉淀物，0℃、3000×g离心10分钟，弃上清；重复此步骤一次；