[发明专利]一种用于筛选防治灰霉病和菌核病的木霉菌株的培养基

说明书

技术领域

本发明涉及菌种筛选技术领域，特别是涉及一种用于筛选防治灰 霉病和菌核病的木霉菌株的培养基。

背景技术

蔬菜产业在我国发展迅速，但始终面临着土传病害的威胁，其中 发生面积较大且危害严重的主要有灰霉病、菌核病等。灰霉病和菌核 病发病的温度、湿度条件基本相同，在低温高湿的条件下易发病。引 起上述两病害的病原菌分别为灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和核盘 菌(Sclerotiniasclerotiorum)，两种菌在侵染植物初期都会分泌草 酸，草酸通过降低pH、螯合Ca²⁺、干预保卫细胞、非特异性毒素等途 径引起或显著增强病原菌致病性，草酸合成缺陷型的灰葡萄孢和核盘 菌无致病性。

木霉菌剂是被广泛用于防治植物病害的拮抗真菌菌剂，占据了 50％的真菌生防制剂的市场份额。目前已证明一些木霉菌株对灰霉病 和菌核病有很好的防治效果，但目前防治灰霉病和菌核病的木霉菌株 筛选的效率较低，而菌株筛选最主要的原因之一就是筛选培养基的问 题。常规的筛选方法主要包括平板对峙培养、木霉水解酶活性平板筛 选、次级代谢物质测定等，其中平板对峙培养法是将木霉与病原菌在 固体培养基中相对位置共培养，以病原菌单独培养的平板为对照，评 价病原菌生长受抑制程度。该方法可在一定程度上反映木霉对病原菌 的拮抗作用，在误判率较高，主要表现在：1)对于生长速度较快的 木霉株系，其气生菌丝会很快覆盖平板，较难判断对病原菌是否有寄 生或消解作用；2)对于生长速度较慢的木霉株系，与病原菌较晚接 触，易误判为抑菌率低。酶活的平板测定方法可快速检测木霉中是否 具有某种水解酶活性，但无法快速判断酶活水平。代谢物质的测定方 法较为复杂，不同的培养环境对其抗生物质的代谢水平影响较大。如 何通过改善培养基来改进筛选方法，进一步提高防治灰霉病和菌核病 的木霉菌株筛选的效率，是本发明需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种用于筛选防 治灰霉病和菌核病的木霉菌株的培养基。本发明所述筛选培养基，添 加了灰霉菌和核盘菌的致病因子草酸，作为筛选靶标，可在20天内 快速筛选得到具有防治灰霉病和菌核病作用的木霉生防菌。

本发明的一种用于筛选防治灰霉病和菌核病的木霉菌株的培养 基技术方案为，所述用于筛选防治灰霉病和菌核病的木霉菌株的培养 基为含有草酸的PDA培养基和含有草酸的PD培养液。

PDA培养基中草酸含量为20-30mmol/L。

PD培养液中草酸含量为20-30mmol/L。

使用上述用于筛选防治灰霉病和菌核病的木霉菌株的培养基筛 选木霉菌株的方法，包括两步：

第一步将活化的待筛木霉菌株置于含有20-30mol/L草酸的PDA培养 基上，设不添加草酸的PDA中培养的对应木霉菌株为对照，在恒温条 件下培养3d；通过测量生长半径计算木霉菌株的草酸耐受率，选择 草酸耐受率大于20％的菌株进行第二步；

第二步将第一步筛选的菌株活化后置于含有20-30mmol/L草酸的PD 培养液中，设不接种木霉的含有20-30mmol/L草酸的PD培养液为对 照，在恒温恒定转速条件下培养12d；用pH计分别检测处理和对照 组的培养滤液的pH，计算处理和对照的pH差△pH，选择△pH大于2 的菌株。

第一步具体为：

(1)活化待筛木霉菌株；

(2)配制含30mmol/L草酸的PDA培养基；

(3)将活化的木霉菌株菌块置于含有30mmol/L草酸的PDA培养基 上，设不添加草酸的PDA培养的对应木霉菌株为对照，设三次重复；

(4)25℃培养箱中，暗培养72hr；

(5)测量接种菌饼的中心点到菌落边缘的距离，其中在菌落边缘选 5个点，分别测量半径并计算平均值；

(6)分别计算处理组和对照组的菌落半径平均值，和木霉的草酸耐受率计算公式为

(7)筛选草酸耐受率>20％的菌株。

第二步具体为：

(1)配制含30mmol/L草酸的PD培养液；

(2)取第一步中筛选得到的木霉菌株，活化至产孢；

(3)配制浓度为10⁷cfu/mL的分生孢子悬浮液；