[发明专利]用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及 方法，属于分子生物学领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphalococcusaureus)属革兰阳性球菌，微球菌科，葡萄球菌 属。它能引起化脓性炎症，当细菌侵入血液时，可引起致病性败血症。

自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的 控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环， 表现为对青霉素的耐药。为此科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲 氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感 染，但随后1961年就发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎 遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。

自从1961年英国发现MRSA后，在欧美及亚洲一些国家相继报道了MRSA所致的院内 感染。从60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美国NNIS报道1975年182所医院MRSA 占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4％，1991年上升至24.8％，其中尤以500张床以上的教学 医院和中心医院为多，因为这些医院里MRSA感染的机会较多，耐药菌株既可由感染病人带 入医院，也可因滥用抗生素在医院内产生。欧洲1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60％。 而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41％。国内在70年代发现有 MRSA，近几年MRSA的检出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占 5％，1988年上升至24％，1996年激增至72％。MRSA感染多发生于免疫缺陷者，大面积烧伤， 大手术后患者，长期住院及老年患者，MRSA极易导致感染的流行和暴发。为有效控制MRSA的 感染，以及降低疾病造成的危害，建立准确，快速的检测方法是首要任务。

目前临床上检测MRSA常用的方法有细菌培养法和PCR法。其中细菌培养法是检测 MRSA的金标准，但该方法需要进行药敏实验，通常需要3-5天才能看到最终的检测结果，检 测成本高、检测周期长；利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增 加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者血液中有往往含有抑 制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限制了PCR检测的临床应用。 目前，已有用荧光原位杂交(FISH)检测MRSA的报道，但均采用的是线形探针，该方法的缺点 是，杂交完成后，必须用严格的洗涤条件来除去未杂交的探针，而且经常会因为探针清洗不 完全而造成假阳性。由此可见，MRSA感染的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种荧光信号强度高、特 异性好、可有效、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子信标探针。

同时，本发明还提供了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒及方 法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌检测的分子信标探针，其包含BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3三种探针； 所述BeaconMRSA1的碱基序列如SEQIDNO:1所示，所述BeaconMRSA2的碱基序列如SEQ IDNO:2所示，所述BeaconMRSA3的碱基序列如SEQIDNO:3所示；所述BeaconMRSA1、 BeaconMRSA2和BeaconMRSA3的5’端均标记有荧光基团，BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和 BeaconMRSA3的3’端均标记有猝灭基团。

本申请发明人通过对比大量MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林 非耐药金黄色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑选出MRSA特有的基因mecA作为检测靶点，并针 对该靶点、在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计、合成三条探针(Beacon MRSA1,BeaconMRSA2和BeaconMRSA3)。这三条探针联合作用，提高了检测的荧光信号强 度，并且特异性高，可以灵敏、有效、快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。