[发明专利]猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子病毒学领域，具体涉及一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧 光定量PCR引物及其检测方法。

背景技术

我国是世界养猪第一大国，猪繁殖障碍性疾病一直是猪场的常见疾病，给猪场和 养猪户造成了严重的经济损失。由于该病病因复杂，一般为多病原的混合感染，临床上较难 控制，治疗效果往往不理想，造成猪群生长缓慢或停滞、病残猪和死亡猪只增多，饲料效率、 生长速度以及猪群整体的均匀度降低，治疗成本增加，影响了猪群的繁殖与改良，威胁着养 猪业尤其是规模化养猪业的发展。猪繁殖障碍性疾病主要是PRRSV、PCV2、CSFV、PPV、PRV等 的一种或几种病毒的混合感染，因此建立快速有效的检测方法非常有必要。

其中，PPV、PRV、PCV2病毒为DNA病毒，目前的诊断方法是近年发展起来的实时荧光 定量PCR。实时荧光定量PCR有荧光染料和荧光探针之分，荧光探针特异性较好但成本增加， 而常用的荧光染料SYBRGreenⅠ因扩增时要求浓度低而使扩增信号相对较弱，无法解决由 低浓度造成的染料重分布问题，而且低熔点的DNA链可能由于染料重分布问题而无法检 测到，使其检测可靠性因此而降低。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的多重EvaGreen实时 荧光定量PCR引物及其检测方法，该方法特异、快速、敏感，能同时检测PCV2、PPV和PRV等DNA 病毒。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR引物，包括以下序列：

PCV2-Sense:5-TGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3，

PCV2-Antisense:5-AAAACCATTACGAAGTGATA-3；

PRV-sense:5-CATGCGACCCTTTCTGCTGC-3，

PRV-Antisense:5-CCCAGACCTCGGCCGAGGGA-3；

PPV-Sense:5-CTGGGGGGTTGGTGTGTCT-3，

PPV-Antisense:5-TCTTGTACCATTTGTCCTTC-3。

一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）参照病毒DNA小量制备试剂盒说明书，分别从感染PK-15细胞的PCV2、PPV和PRV病毒 液中提取病毒DNA；

（2）取0.5μL所得病毒DNA，加入10×PCRbuffer5μL，2.5mmo1/LdNTP混合物4μL、上下 游引物(50pmol/μL)各lμL、灭菌双蒸水38μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，混匀后进行PCR 扩增；扩增程序为：94℃预变性3min，94℃20s，54℃30s，72℃30s，共30个循环，72℃延伸 1min；PCR反应结束后，取5μLPCR产物用3%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mLEB）电泳检测目的条 带，回收目的片段（PCV2、PRV和PPV的目的条带分别为350、140、190bp）；

（3）将回收的目的片段与pGEM-TEasy载体连接，构建重组质粒；将重组质粒转化 E.coliJM109感受态细胞，（用质粒提取试剂盒）提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定， 获得阳性重组质粒；

（4）用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在260nm和280nm处的吸光度，并计算出 重组质粒的DNA浓度与纯度；将重组质粒进行10倍梯度稀释，以10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、 10⁷、10⁸、10⁹拷贝/μL作为标准阳性模板；

（5）将PCV2、PPV、PRV标准阳性模板分别进行荧光定量PCR反应，建立标准曲线，从而 可以得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线表达式；

（6）提取待测样品基因组DNA，进行荧光定量PCR反应，将所得各目的片段的Ct值代入标 准曲线，即可得到待测样品中各病毒DNA的拷贝数。