[发明专利]猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR引物及其检测方法

权利要求书

1.一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR引物，包括以下序列：

PCV2-Sense:5-TGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3，

PCV2-Antisense:5-AAAACCATTACGAAGTGATA-3；

PRV-sense:5-CATGCGACCCTTTCTGCTGC-3，

PRV-Antisense:5-CCCAGACCTCGGCCGAGGGA-3；

PPV-Sense:5-CTGGGGGGTTGGTGTGTCT-3，

PPV-Antisense:5-TCTTGTACCATTTGTCCTTC-3。

2.一种猪繁殖障碍性疾病DNA病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）参照病毒DNA小量制备试剂盒说明书，分别从感染PK-15细胞的PCV2、PPV和PRV病毒 液中提取病毒DNA；

（2）取0.5μL所得病毒DNA，加入10×PCRbuffer5μL，2.5mmo1/L的dNTP混合物4μL、 50pmol/μL的上下游引物各lμL、灭菌双蒸水38μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，混匀后进 行PCR扩增；扩增程序为：94℃预变性3min，94℃20s，54℃30s，72℃30s，共30个循环， 72℃延伸1min；PCR反应结束后，取5μLPCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，回收 目的片段，PCV2、PRV和PPV的目的条带分别为350、140、190bp；

（3）将回收的目的片段与pGEM-TEasy载体连接，构建重组质粒；将重组质粒转化 E.coliJM109感受态细胞，提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，获得阳性重组质粒；

（4）用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在260nm和280nm处的吸光度，并计算出 重组质粒的DNA浓度与纯度；将重组质粒进行10倍梯度稀释，以10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、 10⁷、10⁸、10⁹拷贝/μL作为标准阳性模板；

（5）将PCV2、PPV、PRV标准阳性模板分别进行荧光定量PCR反应，建立标准曲线，从而 可以得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线表达式；

（6）提取待测样品基因组DNA，进行荧光定量PCR反应，将所得各目的片段的Ct值代入 标准曲线，即可得到待测样品中各病毒DNA的拷贝数。

3.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶含 有0.5μg/mLEB。

4.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR的 反应体系为：权利要求1所述引物各1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmo1/LMg²⁺4μL， 2.5mmo1/LdNTP5μL，10×EvaGreen5μL，TaqDNAPolymerase2U，加ddH₂O至反应体系 总体积为50μL。

5.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR的 反应程序为95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环。