[发明专利]一种重组酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。所述重组酵母菌株包含经酵母同源重组整合到基因组上的2个特定基因片段。本发明通过选择特定的组成型启动子组合，搭配红发夫酵母来源的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶双功能酶基因CrtYB、GGPP合酶CrtE、八氢番茄红素去饱和酶CrtI，以及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至酵母菌株基因组上并同源重组敲除ypl062w基因，获得一株全新的无需诱导剂的重组菌株并保证了β‑胡萝卜素的高产。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

类胡萝卜素是一类具有重要生理功能的商业色素。在人体内，β-胡萝卜素(β-carotene)是维生素A的前体，具有抗氧化，预防癌症和增强免疫的潜在功能，它们通常也被用来作为食品和饲料产业的着色剂。目前，化学合成β-胡萝卜素仍然占据大部分市场，但是由于化学试剂的危害性，使得人们寻找其他可代替的方法；天然产类胡萝卜素的藻类和真菌大规模培养是类胡萝卜素生产的另一种主要手段，但是同样存在成本高、污染严重的问题。因此，利用合成生物学手段在微生物体内进行β-胡萝卜素等类胡萝卜素的合成变得越来越有前景。

目前，在微生物异源合成β-胡萝卜素的研究中，所利用的底盘菌主要为大肠杆菌(E.coli)与酿酒酵母菌(S.cerevisiae)。

对于大肠杆菌系统的研究有，2007年，韩国庆尚大学的Yoon S.H.等人在大肠杆菌中引入肺炎链球菌的MVA利用途径，通过外源添加甲羟戌酸，实现了β-胡萝卜素的生产，产量达到了503mg/L；为了进一步提高β-胡萝卜素的产量，Yoon S.H.继续对大肠杆菌DH5α进行改造，引入了来自粪肠球菌由乙酰辅酶A到甲羟戊酸的MVA途径，结合先前的肺炎链球菌下游利用甲羟戊酸的MVA途径，在甘油浓度为2％的条件下培养，使β-carotene达到了465mg/L；国内研究方面，2014年，青岛农业大学的杨建明课题组在大肠杆菌BL21(DE3)中，通过优化内源的MEP途径，引入外源的MVA途径和来自北美冷杉的香叶基焦磷酸合酶(GPPS2)，结合来自草生欧文氏杆菌的β-carotene合成基因，在摇瓶培养条件下β-胡萝卜素的产量达到了256.8±10.4mg/L。

尽管与大肠杆菌相比，在酿酒酵母中生产β-胡萝卜素的产量并不突出，但是酿酒酵母作为真核生物，在利用β-胡萝卜素的抗氧化胁迫以及生产下游β-胡萝卜素的代谢产物上更具有一定的优势。对于酿酒酵母系统，2007年Verwaal等在酵母中通过加强内源途径，过表达八氢番茄红素去饱和酶(CrtI)等手段，得到β-胡萝卜素的产量为5.9mg/g干重；2014年，浙江大学的于洪巍课题组通过分散组装的策略构建β-胡萝卜素的合成路径，酵母在Gal启动子的调控下摇瓶发酵使β-胡萝卜素的产量达到了7.41mg/g的干重；随后，该课题组通过下调ERG9等一系列优化手段，并通过发酵优化将总胡萝卜素的产量提高到1156mg/L(20.79mg/gDCW)，但其中β-胡萝卜素的所占比例较低，仅占总产量的30％。

中国专利CN 104962488A公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，所述重组酵母菌株以敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因的酵母菌株为宿主细胞，选取不同来源的番茄红素环化酶crtY并配合特定来源的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至四敲酵母菌株基因组上9个基因片段，获得一株全新的高产β-胡萝卜素的重组菌株，β-胡萝卜素产量介于18-27mg/gDCW，远远超出了前述重组微生物菌株普遍的6-7mg/gDCW的产量。但是，专利CN 104962488A所获得的重组酵母菌株采用的是Gal诱导型启动子以及配合诱导型启动子整合的基因模块，所述重组酿酒酵母如果生产β-胡萝卜素需要加入半乳糖进行诱导产生，而半乳糖是一种比较昂贵的原料，用于实际生产中会增加成本，无法提高β-胡萝卜素的经济效益，而组成型启动子的重组酿酒酵母暂无相关报道。因此，亟待开发高纯度、高产β-胡萝卜素的组成型启动子的重组酿酒酵母菌株。

发明内容