[发明专利]一种重组酵母菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因组包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

酵母Delta位点上游同源序列Delta1、带有可弹框的URA3标签、启动子TEF1p、Xd CrtE、终止子PDX1t、启动子TDH3p、Xd CrtI、终止子MPE1t、启动子FBA1p、Xd CrtYB、终止子TDH2t、Delta位点下游同源序列Delta2顺次拼接而成的基因片段1；

酵母ypl062w基因上游同源序列、His3标签、终止子PGK1t、启动子TDH3p、融合基因BTS1-ERG20、终止子PGI1t、启动子TEF1p、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、终止子TEF2t、酵母ypl062w基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；

所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1如SEQ ID NO:2中的5106-6683bp所示。

2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述基因片段1序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述基因片段2序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.12069，所述酵母为酿酒酵母BY4741。

5.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。

6.根据权利要求5所述菌株，其特征在于，所述BY系列酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。

7.权利要求1-6任意一项所述菌株在生产β-胡萝卜素中的应用以及在生产以β-胡萝卜素为中间产物的产品中的应用。

8.权利要求1所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将酵母Delta位点上游同源序列Delta1、带有可弹框的URA3标签、启动子TEF1p顺次拼接，获得基因片段3，即Delta1-URA3标签-P_TEF1p；

将启动子TEF1p、Xd CrtE、终止子PDX1t、启动子TDH3p、Xd CrtI、终止子MPE1t、启动子FBA1p、Xd CrtYB、终止子TDH2t顺次拼接，获得基因片段4，即P_TEF1p-Xd CrtE-T_PDX1t-P_TDH3p-XdCrtI-T_MPE1t-P_FBA1p-Xd CrtYB-T_TDH2t；

将终止子TDH2t、Delta位点下游同源序列Delta2顺次拼接，获得基因片段5，即T_TDH2t-Delta2；

步骤2、将基因片段3-5通过醋酸锂法转入到酵母中，通过基因片段3-5中的同源序列连接成基因片段1，即Delta1-URA3标签-P_TEF1p-Xd CrtE-T_PDX1t-P_TDH3p-Xd CrtI-T_MPE1t-P_FBA1p-XdCrtYB-T_TDH2t-Delta2，然后通过Delta位点上、下游同源序列与酵母基因组上Delta位点发生重组而整合到基因组上，获得过渡重组酵母菌株，备用；

步骤3、将终止子PGK1t、启动子TDH3p、融合基因BTS1-ERG20、终止子PGI1t顺次拼接，获得而基因片段6，即T_PGK1t-P_TDH3p-(BTS1-ERG20)-T_PGI1t；

将终止子PGI1t、启动子TEF1p、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、终止子TEF2t顺次拼接，获得而基因片段7，即T_PGI1t-P_TEF1p-tHMGR1-T_TEF2t；所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1如SEQ ID NO:2中的5106-6683bp所示

将酵母ypl062w基因上游同源序列、His3标签、终止子PGK1t顺次拼接，获得而基因片段8，即ypl062w基因上游同源序列-His3-T_PGK1t；

将终止子TEF2t、酵母ypl062w基因下游同源序列顺次拼接，获得而基因片段9，即T_TEF2t-ypl062w基因下游同源序列；

将基因片段6-9通过醋酸锂法转入到过渡重组酵母菌株中，通过基因片段6-9中的同源序列连接成基因片段2，即ypl062w基因上游同源序列-His3-T_PGK1t-P_TDH3p-(BTS1-ERG20)-T_PGI1t-P_TEF1p-tHMGR1-T_TEF2t-ypl062w基因下游同源序列，然后通过ypl062w基因上、下游同源序列与酵母基因组上ypl062w基因发生重组，替换ypl062w基因整合到基因组上，获得所述重组酵母菌株。