[发明专利]一种草坪币斑病菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种草坪币斑病菌的分离方法，包括如下步骤：病样采集：切取具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样；病样保湿培养；病原菌分离：使用接种针挑取在病样表面长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上，22‑25℃黑暗条件培养2d；病原菌纯化：待气生菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上，22‑25℃黑暗条件培养3‑5d，得到目的病原菌。本发明通过对病样进行保湿培养前处理，并结合酸化PDA培养基的使用，可解决币斑病菌分离过程中各种非目标真菌污染的问题，且操作简单，整个过程无需严格的消毒杀菌操作。与传统币斑病菌分离方法相比，分离效率及成功率显著提高。

技术领域

本发明属于植物病原微生物领域，涉及一种草坪币斑病菌的分离方法。

背景技术

草坪币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)是一种重要的植物病原真菌，其寄主种类繁多，可以侵染多种冷季型以及暖季型草坪草。自1932年首次在美国发现并报道以来，现已在全世界范围内分布广泛。前期调查结果显示草坪币斑病在我国20多个省区均有发生。币斑病主要危害草坪草的叶片，造成草坪草的枯黄直至死亡，严重影响草坪的景观美景度。

币斑病主要有初夏和初秋两个发病高峰期，当土壤温度高于18℃、夜间湿度较大时币斑病开始发病，发病初期在草坪上形成约硬币大小的近圆形黄斑块，发病严重时，斑块可连接成大片的枯草区。

币斑病菌不产生孢子，其初侵染来源主要包括潜伏在种子内的病菌组织，越冬休眠的菌丝体或无侵染症状的植株体。病原菌多从寄主的伤口侵入，再侵染主要通过人为或机械的方式传播。侵染后期，受侵染的草坪叶片上常混有多种腐生真菌或细菌，因此在币斑病菌的实际分离过程中常难以快速、准确的分离出目标菌。

常规的币斑病菌分离对病样的采集至分离的时间要求严格，通常在采集的24h之内需要进行病原菌的分离以提高分离成功率，然而实际操作过程中，病样采集后需要长距离运输至实验室才能有条件进行病原菌的分离，此时其它病原杂菌就容易滋生，从而降低目标菌分离成功率；此外常规的分离方法需要对病组织进行严格的消毒处理，而消毒处理的同时可能会杀死目的病菌，致使病原菌的分离效率大大降低。为了有效开展草坪币斑病菌抗药性监测、群体遗传以及致病性等相关的研究，开发一种快速、高效的分离草坪币斑病菌是进行相关研究的必要前提条件。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种高效的草坪币斑病菌的分离方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供的技术方案如下：

一种草坪币斑病菌的分离方法，包括如下步骤：

(1)、病样采集：切取具有典型币斑病症状的病健交接处植株及土壤样本作为病样；

(2)、病样保湿培养：将步骤(1)获得的病样保湿培养2-3天，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8h交替培养；；

(3)、病原菌分离：使用接种针挑取经过保湿培养后在病样表面长出的细丝状菌丝，置于APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养2-3d；

(4)、病原菌纯化：待气生菌丝长出后，切取菌落边缘的菌丝尖端，转入新的APDA培养基上，22-25℃黑暗条件培养3-5d，得到目的病原菌。

步骤(1)中，病样采集工具为土壤取样器。所述的土壤样本的直径为4-5cm、高度为6-10cm。所述的病样装入信封中，室温(温度20-30℃)运输至实验室，置于4℃冰箱中保存。病样装于纸质保存袋如信封中，运输过程透气不易使病样腐烂。

步骤(2)中，将病样置于经过灭菌处理的花盆或穴盘中，喷施无菌水使其湿度不低于80％，优选为88％-95％，使用封口膜密封后将病样置于光照培养箱中进行保湿培养2-3d，培养条件为22-25℃光照16h/18-20℃黑暗8h交替培养。保湿培养的条件为草坪币斑病菌适宜的生长条件。