[发明专利]鸡杆菌的检测引物和探针体系及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物检验检疫领域，具体涉及一种鸡杆菌的检测引物和探针体系及其 检测方法，适合于鸡杆菌的快速鉴定及临床检测。

背景技术

鸡杆菌（Gallibacterium）是由Christensen等于2003年在巴氏杆菌科中重新组合 的1个属，包括原来的鸭巴氏杆菌（Pasteurellaanatis）、输卵管炎放线杆菌 （Actinobacillussalpingitidis）和溶血性巴氏杆菌（HaemolyticPasteurella）。鸡杆菌 是健康鸡体的一种常在菌，但大量研究表明其与蛋鸡场的重要疾病—输卵管炎关系密切， 并具有条件致病性，人工感染可引起SPF鸡的输卵管炎、腹膜炎和败血症等疾病。资料显示 鸡杆菌在国内外的养禽场均有广泛的流行，并可造成严重的经济损失。

目前，鸡杆菌的鉴定方法有表型特征鉴定、荧光原位杂交和属特异性鉴定PCR等。 传统的表型特征鉴定主要包括培养特性、形态染色反应、生理生化特征等繁琐的过程，并且 分离培养中细菌容易丢失；现有的鸡杆菌属特异性鉴定PCR(Gallibacteriumspecific PCR,GS-PCR)是一种简单、快速、准确的鉴定方法，但试验过程中发现该方法对于直接从病 料提取的DNA扩增效果不理想；荧光原位杂交方法操作程序复杂且成本较高，上述现有方法 不适合直接对组织中的病原进行定量检测。因此，建立一种更加敏感、特异的定量检测方法 十分必要。

荧光定量PCR（QuantitativePCR，qPCR）是近年来在传统PCR基础上发展起来的一 种DNA检测技术。由于其具有极高的灵敏度、极宽的检测范围、操作简便快速、特异性强和能 够精确定量等优点，该方法在病原定性和定量检测方面得到了大量的应用。截止目前，尚无 关于鸡杆菌探针法荧光定量PCR检测方法的报道。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种鸡杆菌的检测引物、探针及其检测方法，其高度特 异，且敏感性、重复性好，适合于鸡杆菌的快速鉴定及临床检测。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

GtxA毒素基因是在鸡杆菌中新发现的一个毒力基因，其表达产物具有毒害白细胞活性 和溶血活性，经GenBank数据库比对，该基因核苷酸序列高度特异，因此，经过长期大量的试 验研究，本发明根据GtxA毒素基因并结合其结构等方面的特性，设计筛选特异引物，并进而 建立了鸡杆菌荧光定量PCR检测方法。

设计一种鸡杆菌的检测引物，包括以下序列：

Primer-F：atgggacattctatcgcaaacc

Primer-R：aacggcggtagaggcattag

Probe_IN：FAM-tgttaatacaagtagcgggaaagcggc-TAMRA。

鸡杆菌荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）常规方法提取样品DNA；

（2）合成如SEQIDNO：4所示的gtxA基因部分片段（169bp），并通过SmaI位点克隆至 pUC57质粒中；并设计若干个稀释度的重组质粒作为标准品的模板，利用上述检测引物和探 针体系分别进行荧光定量PCR扩增，根据结果进行分析，建立标准曲线或得到对应标准曲线 方程；

（3）以重组质粒为阳性对照，超纯水为阴性对照，对样品DNA进行鸡杆菌荧光定量PCR检 测。

上述荧光定量PCR的具体反应体系和程序如下：

反应体系25μL：Primer-F1μL、Primer-R1μL、Probe_IN0.5μL、ROXReferenceDye2 1μL、模板DNA1μL、灭菌超纯水20.5μL。

反应程序：95℃5min、95℃10s、60℃34s，重复40个循环。

优选的，所述若干个稀释度为2.53×10⁶、2.53×10⁵、2.53×10⁴、2.53×10³、2.53 ×10²拷贝/μL5个浓度梯度。

本发明具有积极有益的技术效果：

1.本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、 长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了 特异性和高灵敏性的检测引物和探针体系；