[发明专利]掺杂荧光标记生物高聚物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及荧光标记检测技术领域，具体地，涉及掺杂荧光标记生物高聚物及其制备方法和应用。

背景技术

荧光标记抗体试剂是一种重要的生物学/医学检测试剂，其荧光检测原理是：抗体与待测样品中的抗原特异性结合后，用特定波长的激发光照射样品，激发抗体上标记的荧光素，然后检测荧光素发射的荧光。荧光的波长与激发光有一定差异(一般大于激发光)，因此可以用滤光片或单色器将荧光与激发光分离，实现高信噪比的检测。运用此原理的检测仪器有流式细胞仪、荧光显微镜、荧光光谱仪等；检测方法有流式细胞术、免疫荧光成像等。

荧光检测的一个特点和优势是，可以对同一样品进行多通道检测。即用超过2种抗体与样品进行反应，不同抗体上标记不同荧光素，而这些荧光素可以被相同或不同的激发光激发，发射出不同波段的荧光，用滤光片或单色器将不同波段荧光分离后进行检测，可以获得样品中多种抗原的相关信息。

随着荧光检测技术的不断发展，更多参数检测成为了科研或临床应用的新需求，参数的增多需要更多的检测通道以及更多种类荧光素的支持，且这些荧光素应能够被同一波长的激发光激发以简化仪器配置并降低仪器成本。

然而，目前的多种荧光素支持的多通道荧光检测技术仍有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备过程简单，成本低，且回收率高，推广应用价值高的掺杂荧光标记生物高聚物以及利用其的多通道荧光检测手段。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

针对多种荧光素支持的多通道荧光检测技术，目前流式厂商为多参数分析所提供的荧光素除常规的FITC、PE等荧光素外，串联荧光素(tandem dye)成为了一种很好的选择。例如，Cyanine7荧光素本身不能被480～540nm或630nm的激发光激发；但将Cyanine7与PE或APC串联后形成PE-Cyanine7或APC-Cyanine7串联荧光素，则PE-Cyanine7与PE都可以被480～540nm的激发光激发，PE-Cyanine7发射Cyanine7的荧光，可以与PE组成2个检测通道；APC-Cyanine7与APC都可以被630nm的激发光激发，APC-Cyanine7发射Cyanine7的荧光，可以与APC组成2个检测通道。

串联荧光素形成荧光依据据荧光共振能量转移原理(Fluorescence/Resonance Energy Transfer，FRET)，即当一种荧光素(能量供体donor)的发射光谱与另一种荧光素(能量受体acceptor)的激发光谱重叠或更偏短波方向，被激发光照射的供体可能以非辐射方式将能量转移给受体，受体接受能量发射荧光。

但是，目前串联染料依赖于荧光蛋白如PE、APC等作为供体，且制备荧光标记抗体的过程比较复杂：首先要将受体与供体荧光蛋白共价偶联，第二步将结合受体的荧光蛋白纯化得到串联荧光素，第三步将串联荧光素和抗体分别用双功能试剂或二硫键还原剂活化，第四部将抗体与串联荧光素偶联，最后纯化得到偶联产物。并且，依赖荧光蛋白的串联染料标记抗体生产成本昂贵，原因是：1、荧光蛋白需从藻类中提取和纯化,成本远超化学合成制备的荧光素高；2、制备步骤复杂，原材料损失大。3.荧光蛋白分子空间位阻大，与抗体标记的偶联产率低，导致抗体整体回收率低。

而发明人发现，理论分析和实验显示，受体和供体无需预先共价偶联结合成一个“串联荧光素”，只要其空间位置足够近就可能发生FRET。并且FRET现象并不依赖于荧光蛋白，小分子荧光素之间也可以产生FRET能量转移。当一种荧光团(受体)的激发光谱与另一种荧光团(配体)的发射光谱存在重叠，并且这两种荧光团之间的距离小于10nm时，这两个荧光团之间可能发生非辐射的FRET作用；而当两种荧光距离较远时，不会发生FRET作用。由此，发明人发现，将适于发生荧光共振能量转移的多种荧光素同时标记在同一个抗体分子上，能够基于FRET作用开发出新的荧光标记抗体，其性能与串联荧光素标记的抗体类似，即可以与荧光供体共用一种波长的激发光，而可以发射荧光受体的荧光，应用于荧光检测时，能够拓宽荧光标记物种类的选择空间，增加实验设计的灵活性，并降低对检测仪器的要求，但相对于串联荧光素制备过程简单，成本大大降低。