[发明专利]一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法

说明书

本发明属于利用蛋白质组学分析技术研究蛋白质微观构象的研究领域，涉及一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，具体为一种结合活性共价化学标记和质谱技术来检测蛋白质构象变化的方法，在整体蛋白质层次上对赖氨酸残基进行活性化学标记，随后进行蛋白质变性、酶解并用质谱进行检测，通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。该方法快速简单、稳定高效，能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化，在标记过程中蛋白质活性保持不变，不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制，能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下的构象。

技术领域

本发明属于利用蛋白质组学分析技术研究蛋白质微观构象的研究领域，具体涉及一种活性共价化学标记和质谱检测技术相结合的方法，考察蛋白质构象以及赖氨酸在活性蛋白质中的局部结构微环境变化。

背景技术

质谱技术在提供蛋白质结构信息方面有着巨大优势，和其他技术如X射线晶体衍射和核磁共振相比，它不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制(文献1.Aebersold R,MannM.Mass spectrometry-based proteomics.Nature,2003,422(6928):198-207)。在应用质谱技术考察蛋白质结构时，通常需要对蛋白质进行化学标记处理，而氢氘交换和共价化学标记是最常用的标记策略(文献2.Konermann L,Vahidi S,Sowole M A.Massspectrometry methods for studying structure and dynamics of biologicalmacromolecules.Analytical chemistry,2013,86(1):213-232)。氢氘交换是一种活性标记的方法，不会改变蛋白质的生物活性。但是，氘氢的“回交(back exchange)”效应在很大程度上影响了这种方法的准确性(文献3.Scholten A,Visser N F C,van den Heuvel R HH,et al.Analysis of protein-protein interaction surfaces using a combinationof efficient lysine acetylation and nanoLC-MALDI-MS/MS applied to the E9:Im9bacteriotoxin-immunity protein complex.Journal of the American Society forMass Spectrometry,2006,17(7):983-994)。相比之下，稳定共价标记策略通常是修饰具有高反应活性的氨基酸残基侧链，例如赖氨酸残基的侧链伯胺基团。然而，大多数共价标记方法为了确保较高标记效率需要使用高反应活性的酰胺化反应试剂，如N-acetyl-succinimide,sulfosuccinimidyl acetate和S-methylthioacetimidate，这些试剂会中和赖氨酸侧链的正电荷，影响蛋白质中的静电相互作用，从而导致标记后蛋白质结构的改变以及活性的丧失(文献4.Kvaratskhelia M,Miller J T,Budihas S R,etal.Identification of specific HIV-1reverse transcriptase contacts to theviral RNA:tRNA complex by mass spectrometry and a primary amine selectivereagent.Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99(25):15988-15993)。结合活性共价化学标记和质谱检测技术研究蛋白质构象至今尚未有报道。