[发明专利]一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法

权利要求书

1.一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法，具体为一种结合活性共价化学标记和质谱技术来检测蛋白质构象变化的方法，其特征在于：在保持蛋白质天然结构和生物学活性状态下，在蛋白层次上通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应，再用质谱技术检测赖氨酸残基的标记效率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将甲醛和氰基硼氢化钠加入活性蛋白质溶液中，随后进行蛋白质溶液的变性和酶解得到肽段溶液，用色谱对肽段溶液进行分离再用质谱进行检测，通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：对于构象发生变化的同种蛋白或蛋白复合物，分别在活性状态下，在蛋白层次上通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1) 取蛋白质样品，溶于pH 7.0-8.0的HEPES 溶液中，得到活性蛋白质溶液；

(2) 向上述步骤(1)得到的活性蛋白质溶液中加入甲醛(CH₂O)和氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)；

(3) 向上述步骤(2)得到的溶液中加入碳酸氢铵(NH₄HCO₃)；

(4) 将上述步骤(3)得到的溶液煮沸，使蛋白变性，然后加入蛋白酶，20-40 ℃水浴中酶解得到肽段溶液；

(5) 对上述步骤(4)得到的酶解肽段溶液酸化处理，进行液相色谱分离和质谱检测；

(6) 将上述步骤(5)得到的质谱数据进行数据库检索，根据检索结果计算各个赖氨酸残基的标记效率。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：采用有机溶剂、紫外光照、高温加热的方式处理得到发生构象变化的蛋白质。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述活性蛋白质溶液的浓度为0.01-10 μg/μL；

步骤(2)所述的CH₂O和NaBH₃CN的终浓度均为0.01-100 mmol/L，反应温度为4-40 ℃，反应时间为5-200 min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中甲醛和氰基硼氢化钠的摩尔浓度比的范围为1-10；

步骤(3)中碳酸氢铵与甲醛的摩尔浓度比的范围为10-100；

步骤(4)中煮沸温度控制在90-100 ℃范围内。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述赖氨酸残基标记效率的计算方法是：

L_赖氨酸 = (N₁/N₂) × 100%

式中，L_赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率，N₁为质谱鉴定到的标记肽段的谱图数，N₂为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数；

或

L_赖氨酸 = (A₁/A₂) × 100%

式中，L_赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率，A₁为质谱鉴定到的标记肽段的质谱检测峰面积，A₂为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总峰面积。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白质构象变化是指蛋白质或蛋白质复合物原本紧密有序的空间结构变得松散。