[发明专利]一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及基于酶修复循环三次放大的荧光生物检测方法，包括拱形探针的构建；酶修复循环信号放大、荧光检测；利用了核酸适配体的特异性识别，利用核酸适配体对目标物沙门氏菌的高特异性检测；利用酶修复循环放大，实现信号放大的作用。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别涉及循环方法荧光法检测沙门氏菌的方法。

背景技术

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年会导致约四万美国人病倒，约600人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。沙门氏菌病的临床症状主要包括头痛、腹痛、发热等，死亡率在1 %，对人危害很大。

目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、PCR技术等。传统的沙门氏菌检测方法检测周期长达一周，工序繁琐，设备昂贵等，这远远不能满足要求。因此，食品工业急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于酶修复循环放大的荧光法检测沙门氏菌的方法。

本发明还提供了基于核酸内切酶IV修复循环放大的荧光检测沙门氏菌的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：

Trigger：5’-TCTTTTCC AAAA CGGGCATTACT-3’（SEQ ID NO:1）；

Aptamer : 5’-AGT AAT GCC CG GTAGTTATTCAAAGATGAGTA GGA AAA GA -3’（SEQID NO:2）；

HAP： 5’- CTTGCGCTTGAGCCCTGTGTCCCGTCATGCGAGTAATGCCC -3’（SEQ ID NO:3）；

Signal probe： 5’- （FAM）CTTGXGCTTG（Dabcyl） -3’（SEQ ID NO:4）；

其中Signal probe 的5’端修饰荧光基团FAM，3’端修饰猝灭基团Dabcyl。HAP既用作聚合酶合成DNA的模板，又可以在UDG和核酸内切酶IV的作用实现信号的放大，同时产生与Signal probe互补的D’链。HAP总共包括四部分和两个酶切位点分别是：A（黑体部分）能够与Trigger部分互补，在聚合酶作用下Trigger作引物，HAP为模板，进行DNA链的延长。B（黑体下划线部分）维持发夹的稳定和两个酶切位点。C（斜体部分）用于诱导进一步的循环放大，产生的C’与其完全互补，且C’也能够打开发夹实现另一个循环。D（斜体下划线部分）产生与Signal probe完全互补的D’， D’ 与Signal probe通过碱基互补配对形成双链，在核酸内切酶IV作用下，将Signal probe剪切成两部分，使得荧光基团（FAM）和猝灭集团（Dabcyl）分离，从而产生荧光信号。通过测量荧光强度来定量检测沙门氏菌。

本发明中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合实现三循环，使得信号放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。