[发明专利]一种利用钩状效应拓展检测范围的生物芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外免疫分析技术领域，具体地涉及了一种生物芯片及其检测方法，可以显著的扩展生物分子的检测范围。

背景技术

抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应，体外的抗原抗体的结合主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测复杂样品中药物、激素、蛋白质、微生物等物质存在或者浓度的分析方法。这种分析基于抗体的特性，即它只和一种或非常有限的几种分子发生特异性结合。将生物芯片用于免疫分析，可大大改善免疫分析性能。例如，缩短反应时间，提高分析效率，节约试剂和样本，以及易于集成化，便携化，操作简便，更易实现自动化。

按反应机制的不同，免疫分析可以分为竞争法和非竞争法。非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物，产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将待测抗原与定量标记抗原(直接竞争)或者固定抗原(间接竞争)竞争结合形成定量的特异性抗体-抗原复合物，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原或者固定抗原的量越少，产生的信号强度越小，由此定量待测抗原的量。非竞争法中经典的双抗体夹心免疫反应的原理是以抗原为检测靶标，在固相载体的表面通过物理吸附或者化学键合的方式固定上捕获抗体，溶液中抗原分别与标记抗体和捕获抗体相结合，进而形成捕获抗体-抗原-标记抗体三元复合物，通过对标记抗体上标记物的检测，实现对抗原的定量检测。这种技术已经广泛应用于临床、环境、食品、海关等的检测中。当捕获抗体及标记抗体的用量和活性足以结合标本中的被测抗原时，双抗体夹心免疫检测的信号强度随待测抗原浓度增加呈现单调递增的关系；而当标本含有高浓度待测抗原，即捕获抗体及标记抗体的用量及活性相对不足，或者高浓度待测抗原引发的检测信号超出仪器的线性检测范围时，校准曲线的信号强度与待测物浓度常常会发生偏离线性，信号强度随待测抗原浓度增加呈现下降的趋势(此种现象即为钩状效应)，从而使免疫检测失去准确定量高浓度待测抗原的能力。钩状效应在免疫检测中经常发生，其发生率占阳性样本30％左右，由于钩状效应会使待检样本的浓度超出检测范围却输出一个相对低值，造成假阴性结果导致误诊。一般需要对超过检测范围的样本进行稀释进行复测，然后反推计算结果，这样浪费了试剂，又比较繁琐。

为减小夹心免疫分析中钩状效应的影响，很多人做了研究工作。通过增大标记抗体用量可以适当缓解这种效应，但是当提高标记抗体用量时，响应信号强度增大往往会超出仪器的检测范围，仍然制约高值样本的检测。Neumann等人的美国专利US6,184,042-B1中提出在固相存在下培养样品，使用能与被分析物结合的抗体低聚物或者抗体片段的低聚物作为标记抗体，因为抗体低聚物能结合更多的抗原，可以减轻钩状效应影响，这本质上和提高标记抗体浓度的方式相似，当样本抗原浓度很高时并不能完全解决钩状效应的问题，且制作抗体低聚物的操作比较繁琐。中国专利CN101201353B中提到一种扩展免疫检测可测量范围的方法及试剂盒，在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上(例如微球)分别通过双抗体夹心法(检测微球)和竞争法(指示微球)测定样品浓度，双抗体夹心法检测处于双抗体夹心法线性范围内(上升段)的样品浓度，免疫竞争法测定处于双抗体夹心法线性范围外(钩状效应区)的样品浓度。该法使用微球作为固相载体，并用指示微球的信号值作为判断夹心免疫反应是否会出现钩状效应的判据，该法能从一定程度上拓宽了夹心免疫的检测范围(一个数量级)，但对于生物体发生疾病体内含量升至很高的生物分子比如甲胎蛋白、D-二聚体、C-反应蛋白、噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白等仍需进一步拓宽检测范围。使用该法测定生物分子时，因为用于指示的微球要结合双抗体夹心法反应后剩余的标记抗体，双抗夹心法和竞争法的过程是先后进行的，浪费了时间，操作不便。中国专利CN10132644B介绍了一种在钩状效应区域内具有检测能力的侧流测定装置，该装置使用两种受体材料作为结合分析物的探针，分为检测区和指示区，检测区内固定有第一受体材料，该受体材料优先与分析物结合，然后检测探针与被受体材料捕捉的分析物结合，结合后的检测探针被固定在检测区域内；指示区内固定有第二受体材料，该第二受体材料优先与未与分析物反应的检测探针结合。指示区的第二受体材料要结合检测区域与第一受体发生反应后剩余的检测探针从而起到指示作用。指示区必须位于检测区下游。这种先进行检测区反应然后进行指示区反应的方式在原理上跟专利CN101201353B是一致的。该方法节省时间，但受控于检测区和指示区物理位置，不够灵活。