[发明专利]支撑P450脂肪酸脱羧酶活性的还原伴侣蛋白组合及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物能源和酶工程领域，具体涉及一种能够支撑P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE催化脂肪酸脱羧产生α烯烃活性的还原伴侣蛋白组合及其应用。

背景技术

当今，能源问题已经成为世界各国涉及社会经济发展、国家安全、国际地缘政治以及环境保护的重要问题(Shafiee&Topal,2009；Steen et al.,2010)。在我国能源需求高速增长的同时，化石燃料资源(石油、天然气、煤等)迅速消耗；水利资源的过度开发对生态环境造成了巨大压力；核能利用中的安全问题仍有争论；风能、太阳能等洁净能源的能量密度较低。因此，生物燃料因其可再生性、环保及低碳排放等特点受到了世界各国的高度重视(Liao et al.,2012)。由生物储能物质脂肪酸衍生而来的脂肪烃类生物燃料因其所具有的高能量密度、低吸湿性、与现有发动机系统和运输设施相兼容等特性被认为是最理想的石油类燃料替代品(Keasling&Chou,2008；Li et al.,2010；Rude&Schirmer,2009)。

来源于咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456)的P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE不仅能以H₂O₂作为氧供体和电子供体催化不同链长的脂肪酸发生脱羧反应生成相应链长的α烯烃(Rude et al.,2011)，而且也能够分别以O₂，NAD(P)H作为氧供体和电子供体，在还原伴侣蛋白的支撑下，催化脂肪酸脱羧反应(Liu et al.,2014)。研究发现来源于红球菌(Rhodococcus sp.NCIMB 9784)的还原伴侣RhFRED可支撑OleT_JE催化豆蔻酸(myristic acid)脱羧生成相应的α十三烯(1-tridecene)(Liu et al.,2014)。利用来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的铁氧还蛋白Pdx和铁氧还蛋白还原酶PdR亦可支撑OleT_JE脱羧短链脂肪酸(C₄-C₉)生成相应α烯烃(Dennig et al.,2015)。

从催化机理来看，依赖于还原伴侣蛋白的P450脂肪酸脱羧系统需要还原伴侣蛋白从还原型辅酶NAD(P)H依次输送两个电子到P450亚铁血红素(heme iron)反应中心，协同两个来源于酸性氨基酸的质子活化分子氧(O₂)，以产生具有高反应性氧高铁酰自由基复合物(Fe⁴⁺＝O^+.)以氧化底物(Sono et al.,1996)。

相较于依赖于H₂O₂的系统来说，还原伴侣系统避开了H₂O₂对于生物系统(细胞和酶)的毒性，在利用工程微生物高效合成α烯烃的实际应用中非常重要。此外，由于H₂O₂本身所具有的不稳定性和易分解性，还原伴侣系统支撑的P450脱羧系统在催化效率和稳定性方面具备明显优势。具体而言，对于P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE，目前尚不清楚何种还原伴侣蛋白能够高效支撑其催化活性，而优化的还原伴侣蛋白组合无疑将对未来利用OleT_JE催化生产α烯烃中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供支撑P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE活性的还原伴侣蛋白组合及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种支撑P450脂肪酸脱羧酶活性的还原伴侣蛋白组合，支撑P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE催化脂肪酸脱羧产生α烯烃活性的还原伴侣蛋白组合为铁氧还蛋白(ferredoxin)、铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase)和辅酶。

所述辅酶为NADH或NADPH。

所述铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶组合按摩尔浓度比为(1-10):1的比例混合。

所述组合中铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶分别源于聚球藻(Synechococcus elongatus PCC 7942)或谷棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)。