[发明专利]一种检测血清中循环microRNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种检测血清中循环microRNA的方法。

背景技术

microRNA（miRNA）是长度为21~25个核糖核苷酸的内源性非编码小单链RNA分 子，在众多细胞基因表达途径的调节中扮演着重要的角色。它们通过结合到mRNAs的3' 端非翻译区，来调节mRNA的断裂或者阻止蛋白的合成。据报道，3'端非翻译区受到优先 保护，miRNAs调控人类60%的基因。Calin小组首次发现miRNAs与人类癌症的关系，并 在许多类型的肿瘤中发现miRNAs表达的改变。一些miRNAs是肿瘤的抑制基因，另一些则 是直接或间接的致癌基因。此外，迄今已发现，miRNA能够抵抗RNA酶的降解、极端pH和 温度条件的破坏，且能够在提取后或直接在血清或血浆中检测。这些发现表明用血清中的 循环miRNAs作为一种标志物，对促进基础生物医学研究的进步和帮助癌症的诊断具有重 要意义。因此，我们急需构建一种能够快速、灵敏检测miRNAs的方法。

目前，已有许多miRNA的检测分析方法被报道，包括RNA印记法、微阵列芯片检 测法、毛细管电泳法、电化学生物传感器法和荧光技术检测法（实时定量PCR）等。其中，荧 光检测技术由于具有灵敏度高、选择性好、分析快速和整体成本效益好等优点，是最常使用 的miRNA检测技术。同时，该检测技术提供了包括波长、荧光寿命和强度的多个荧光检测 参数，增加了检测的灵活性。

实时定量PCR（qRT-PCR）作为一个强大的荧光技术检测工具被用于miRNA的高灵 敏和准确的定量分析。然而，qRT-PCR通常需要对实际样本中的miRNA进行分离和纯化。 此外，miRNA的长度比较短，给PCR引物的设计增加了困难。为了在不降低检测能力的前 提下取代PCR，研究人员开发了许多基于荧光的信号放大检测方法，如基于发卡结构的放 大方法、等温链置换聚合酶反应法（ISDPR）和滚环扩增放大法（RCA）。然而这些方法大都需 要在检测前从实际样品中提取总RNA，使得这些方法变得复杂而且需要耗费大量劳力。因 此，开发一种可用于实际样品中循环miRNA直接检测的简单方法具有重要意义。

p19RNA结合蛋白，来自康乃馨意大利环斑病毒，是一个RNA沉默的抑制因子。 它能够以很高的亲和力（纳摩尔水平）结合特定大小和序列的双链RNA（dsRNA），而不会与 ssRNA、rRNA、mRNA、ssDNA或者dsDNA结合。p19RNA结合蛋白结合力的大小取决于dsRNA 双链区域的长度，它能与含21-23对碱基的dsRNA牢固结合，而与具有24-26对碱基的 dsRNA的结合力逐渐减弱，其与19个碱基对或者更短的dsRNA结合力较差。基于上述奇特 的结合性质，研究人员开发了与p19蛋白相关的亲和力毛细管电泳检测方法和电化学检 测方法。这些方法对miRNA的检测具有很高的灵敏度和选择性。然而在实际样品检测中， 电泳分离的条件很难优化。另一方面，血清中高含量的蛋白质和其它成分通过非特异性吸 附可干扰电极并产生错误的信号。本发明利用p19蛋白的特性，开发了一种简单的基于 p19蛋白修饰的磁性微球（PFMBs）特异性富集和滚环扩增技术（RCA）的循环miRNAs检测 方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种简单的方法用于血清中循环microRNA（miRNA）的检测， 通过利用PFMBs特异性富集目标物及降低背景信号，并结合RCA进行信号放大，所建立的方 法具有很高的灵敏度，且本发明可直接用于实际样品中循环miRNA的定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案；

一种检测血清中循环microRNA的方法，包括以下步骤：通过杂交形成双功能探针/ miRNA的复合物，用p19蛋白修饰的磁性微球对目标miRNA进行富集以及利用滚环扩增技 术进行信号放大；具体步骤如下：

（1）双功能探针与目标miRNA杂交形成双链的dsRNA，dsRNA通过与p19蛋白修饰的磁性 微球特异性结合被捕获，通过加热可将dsRNA从蛋白修饰的磁性微球上释放收集起来得到 双功能探针/miRNA复合物；

（2）将步骤（2）释放出的双功能探针/miRNA复合物中的双功能探针作为引物进行RCA 反应，得到含有几千个重复序列的长线形单链DNA，加入检测探针，与RCA产物进行杂交 形成dsDNA；