[发明专利]一种检测血清中循环microRNA的方法

权利要求书

1.一种检测血清中循环microRNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：通过杂交形成双 功能探针/miRNA的复合物，用p19蛋白修饰的磁性微球对目标miRNA进行富集以及利用 滚环扩增技术进行信号放大；具体步骤如下：

（1）双功能探针与目标miRNA杂交形成双链的dsRNA，dsRNA通过与p19蛋白修饰的磁性 微球特异性结合被捕获，通过加热可将dsRNA从蛋白修饰的磁性微球上释放收集起来得到 双功能探针/miRNA复合物；

（2）将步骤（2）释放出的双功能探针/miRNA复合物中的双功能探针作为引物进行RCA 反应，得到含有几千个重复序列的长线形单链DNA，加入检测探针，与RCA产物进行杂交 形成dsDNA；

（3）将荧光染料嵌入剂嵌入步骤（2）所述的dsDNA溶液中可获得强荧光，从而实现目 标miRNA的灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的双功能探针由两部分构成， 一部分与目标miRNA的核酸序列互补，另一部分是DNA核酸序列，用做RCA反应的引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的双功能探针和miRNA分散在 结合缓冲液中，所述的结合缓冲液含有20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，1mM TCEP和0.02%Tween-20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的dsRNA，具体合成步骤为：取 10μL双功能探针与500μLmiRNA加入到490μL结合缓冲液中在30℃下孵育2小时得到 dsRNA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述p19蛋白修饰的磁性微球的制备 通过以下步骤实现：磁性微球在使用前先分散在结合缓冲液中，并简单的进行震荡；然后将 p19蛋白加入到磁性微球分散液中，室温震荡30分钟后，用磁石进行磁性分离，移除上清液 并用结合缓冲液洗两次得到p19蛋白修饰的磁性微球。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述JP探针/miRNA复合物的捕获与 收集通过以下步骤实现：将15μLp19蛋白修饰的磁性微球加入到所述的1mLdsRNA溶液中， 在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗涤5次；用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁， 移除溶液，剩余物质分散在DEPC处理过的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，得到双 功能探针/miRNA复合物。

7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于：所用的洗涤缓冲液中含有20mMTris- HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，100μg/mlBSA。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的RCA反应具体通过以下步骤 实现：取步骤（1）中收集的JP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂，2mM(NH₄) ₂SO₄，0.4mMDTT，1mMdNTP和环形DNA模板的Tris-HCl缓冲液中；往上述溶液中加入DNA 聚合酶于30℃RCA聚合反应3小时；随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA 反应；溶液冷却至室温后，往溶液中加入检测探针进行杂交反应，30℃反应1小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的荧光染料嵌入剂加入的体 积为3μL；用pH7.5的PBS将有荧光染料嵌入剂嵌入的dsDNA溶液稀释到600μL；在室温 下反应15分钟后测定荧光光谱。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的荧光光谱是用F4600荧光分光光度 计，激发波长为480nm，发射波长为500-650nm，最大发射峰为530nm。