[发明专利]一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法和试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于基因组DNA提取领域，具体涉及一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法和试剂盒。

背景技术：

土壤甲螨等是小型节肢动物，个体通常小于1mm，这种小型节肢动物的鉴定一般是通过对其制作玻片标本后进行鉴定，这种方法专业性强，鉴定难度大，随着DNA条形码技术的发展，几乎所有主要的动物类群都在构建所选择基因区域(如COⅠ)的综合序列数据库，并建立相应的凭证标本馆藏。

根据常规的DNA提取方法，获得小型节肢动物的DNA条码需要对整个个体进行研磨，从而破坏了小型节肢动物个体的形态，造成凭证标本不能保存或不能完整的保存，如果将几个甚至几十个个体混在一起，又很难保证DNA模板来源的单一性，为后续的结果分析带来很大的麻烦。近来，越来越多的学者也在不断摸索针对微小节肢动物个体的新的DNA条码获取方法，有些报道通过将微小节肢动物个体整只进行裂解，以获得DNA条码并达到凭证标本不被破坏的目的，但是很多微小节肢动物个体具有很厚的几丁质保护壳，例如土壤甲螨，如果不研磨，只通过裂解液很难获得足够浓度的DNA模板。目前，具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的DNA条码获得方法相关发明未见公布，因此很有必要研究一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的DNA条码获得方法和试剂盒。

几丁质酶的作用是降解几丁质的糖苷酶，以往的研究中，大多数都是对几丁质酶的基因结构、几丁质酶在植物病害防治中的作用或利用几丁质酶测定活性等方面的研究，未发现有利用几丁质酶消化小型节肢动物几丁质壳并用于基因组DNA提取的报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法和试剂盒，利用该方法既能获得较高质量DNA模板和保证模板DNA的单一来源性又能保证凭证标本不被破坏，同时与以往的形态鉴定相比能大大减少对形态专家的依赖性，减少主观性，提高鉴定的准确性。

本发明的具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法，其特征在于，将具厚几丁质外壳微小节肢动物用几丁质酶处理后，然后加入裂解液中裂解后，获得基因组DNA。

优选，所述的裂解液为：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。

优选，是将具厚几丁质外壳微小节肢动物放置于含1mg/ml几丁质酶的pH6.0磷酸缓冲液中，25℃消化24小时，然后将消化后的具厚几丁质外壳微小节肢动物放置于裂解液中，56℃裂解24h，获得基因组DNA，所述的裂解液为：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。

本发明的第二个目的是提供一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取试剂盒，包括DNA提取试剂，其特征在于，还包含几丁质酶工作液和裂解液。

优选，所述的裂解液为：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。

优选，所述的几丁质酶工作液是含1mg/ml几丁质酶的pH6.0磷酸缓冲液，所述的裂解液为：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。

所述的DNA提取试剂盒中优选还包括洗液A(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中GD)，洗液B(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中PW)、正向引物LCO14905’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’、反向引物HCO21985’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’、dNTP、含Mg²⁺的10×Buffer和Taq酶。

利用本发明的方法和试剂盒可以既能获得较高质量DNA模板和保证模板DNA的单一来源性又能保证凭证标本不被破坏，同时与以往的形态鉴定相比减少对形态专家的依赖性，减少主观性，提高鉴定的准确性，具有广泛的应用前景。

附图说明：