[发明专利]一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术一步法检测寨卡病毒NS1基因的试剂盒。

背景技术

寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起并通过蚊媒传播的一种自限性急性疾病，主要通过埃及伊蚊叮咬传播。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关。带病毒的伊蚊叮咬是本病最主要的传播途径。传播媒介主要为埃及伊蚊，白纹伊蚊、非洲伊蚊和黄头伊蚊也可能传播该病毒。亦可通过母婴传播，包括宫内感染和分娩时感染。乳汁中可检测到寨卡病毒核酸，但尚无通过哺乳感染新生儿的报道。罕见血源传播和性传播。

寨卡病毒于1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到。2007年以前，全球仅报告14例寨卡病毒病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情，其后发现寨卡病毒感染病例和暴发疫情的国家及地区有增加趋势。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒病病例，截至2016年1月，至少在非洲、亚洲、美洲的45个国家有寨卡病毒传播的证据，以巴西疫情最为严重。我国广东省、台湾也报告2例来自泰国的输入性病例。在寨卡病毒疫情发生时，巴西等国新生儿小头畸形病例数显著增加，现有证据提示，新生儿小头畸形可能与孕妇寨卡病毒感染有关。疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的可能因果关系，引起了国际社会的广泛关注。寨卡病毒病主要在全球热带及亚热带地区流行。

我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。根据监测，我国有与传播寨卡病毒有关的伊蚊种类主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊，其中埃及伊蚊主要分布于海南省、广东省雷州半岛以及云南省的西双版纳州、德宏州、临沧市等地区；白纹伊蚊则广泛分布于我国河北、山西、陕西以南广大区域。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。因此，建立一种快速检测寨卡病毒病原体的方法具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对寨卡病毒NS1基因进行检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确检测寨卡病毒。

根据GenBank中登录的寨卡病毒的NS1基因序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用Oligo7.0软件根据病毒基因的保守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。引物和探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。

本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPCH2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

本发明的一个优选实施方案是引物、探针混合液由特异性的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TACAAGTACCATCCTGACTCCC-3’，5’-CYGTCAGTTGYACTCCATTCTC-3’；特异性的探针的序列是5’-AGCTCCCCTTCYACTGATYTCCACAT-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。

本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.2～0.5μmol/L，探针浓度为0.1～0.25μmol/L。

本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0～8.8)、MgCl₂(3～8mmol/L)、KCl(150～350mmol/L)组成。