[发明专利]一种微生物胞外多糖及其制备方法

权利要求书

1.一种微生物胞外多糖的制备方法，包括：

1)利用保藏编号为CCTCCNo:M2016035的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液；

2)将步骤1)得到的胞外多糖发酵液加水稀释，离心，收集上清液，真空浓缩至原体积，加乙醇进行醇沉，收集沉淀干燥后即获得胞外多糖粗品；

3)取步骤2)制取的胞外多糖粗品，加缓冲液分散，经DEAE-Sepharose FastFlow离子交换柱分离，得到EPSI和EPSII两个组分，分别收集EPSI和EPSII适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，获得SFEP-01菌株胞外多糖组分EPSI和EPSII纯品；

步骤1)中假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵的方法包括步骤如下：

①将假单胞菌SFEP-01接种于新鲜斜面菌种培养基上，25-30℃培养1-2天得活化菌体；

②将步骤①制得的活化菌体接种于液体种子培养基中，25-30℃培养8-24小时，得种子液；

③将步骤②制得的种子液接种至发酵培养基，25-30℃发酵48－72小时至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液。

2.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，斜面菌种培养基为(g/L)：葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5，琼脂粉15-20，pH值调至7.0-7.2；

液体种子培养基为(g/L)：碳源10-60，酵母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2；

发酵培养基为(g/L)：碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，液体种子培养基和产胞外多糖发酵培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐。

4.根据权利要求3所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述碳源为甘油。

5.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中，发酵液加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离心10-20min，收集上清液然后再40-60℃浓缩至原发酵液体积，加入1-3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。

6.根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶解分散形成胶体溶液；

DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-SepharoseFastFlow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡，将粗多糖样品用0.05mol/L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离；

葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为：将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-SepharoseFastFlow分离的单一组分浓缩上样，用相同的缓冲液洗脱，洗脱流速1-2BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥。

7.根据权利要求1-6任一项制备方法制备得到的胞外多糖。