[发明专利]一种高活力漆酶液的制备方法

说明书

本发明公开了一种高活力漆酶液的制备方法，包括如下步骤：步骤一，使用固体斜面活化栓菌以制备斜面种子；步骤二，将斜面种子在种子培养基中接种培养以制备种子培养液；步骤三，将种子培养液在发酵培养基中进行发酵产漆酶。所获高活力漆酶液的发酵制备工艺简单、稳定，具有周期短、重复性好等特点，所生产的漆酶液可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高活力漆酶液的制备方法。

背景技术

栓菌属微生物，属于担子菌门的白腐真菌(white-rot fungi)。白腐真菌靠降解木质素—纤维素材料的能力穿入木质，侵入木质细胞腔内，释放降解性酶，导致木质腐烂并呈白色，是降解芳香化合物能力最强的微生物。

漆酶(EC 1.10.3.2)，属于蓝多铜氧化酶(blue multicopper oxidases,MCOs)家族的一种，能够在氧气作为电子受体的条件下氧化芳香族化合物，且底物作用特异性低。漆酶不仅可以氧化多酚类芳香族化合物，还可以利用在小分子介体的介导下形成的漆酶/介体体系(LMS)氧化非酚类物质或其它更为复杂的大分子。漆酶可选择性的去除木质纤维素中的木质素，有效地对偶氮染料进行脱色，还可以去除环境中酚类药物或其它类似毒性物质。因此，漆酶在生物质能源、纺织、造纸、废报纸脱墨、食品、生物修复和生物传感器等领域具有重要的研究和应用价值。

漆酶广泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、细菌和昆虫等物种中也有发现。研究指出高等真菌，尤其是担子菌门的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生产菌种。白腐真菌主要利用分泌出的过氧化物酶(LiPs、MnPs和漆酶)对木质素进行催化氧化反应，从而降解木质素分子。与其它两种木质素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一个实现工业化生产和应用的木质素降解酶。白腐真菌的产酶水平一般在几个至几十个单位每毫升之间不等，极少能够达到100U/mL以上，且发酵时间通常在两周左右，甚至达到一个月之久，使得产酶水平低和产酶周期长成为目前限制漆酶工业化生产和应用的主要瓶颈问题。

由于摇瓶发酵与工业大生产发酵在发酵级别和发酵工艺方面存在巨大差异，因此工业酶制剂在研发到生产的历程中，必须经历一个实验室逐级放大发酵的过程。小型发酵罐内发酵工艺参数的获得可为酶发酵的工业放大提供基本参考数据和时间基础，在酶的工业化生产中具有极其重要的地位。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种高活力漆酶液的制备方法，目的是得到较高活力的漆酶液，所生产的漆酶液可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种高活力漆酶液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，使用固体斜面活化栓菌以制备斜面种子；

步骤二，将斜面种子在种子培养基中接种培养以制备种子培养液；

步骤三，将种子培养液在发酵培养基中进行发酵产漆酶。

所述栓菌保藏编号为：CCTCC NO：M2015191，拉丁文名称为Trametes sp.LS-10C，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年04月03日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

斜面种子的具体制备方法为：将该栓菌的超低温(-80℃)甘油冻结管保藏管取出，在10～25℃温度下缓慢回温并溶解，使用无菌接种环挑取含有栓菌菌丝的保藏液体并划线固体斜面培养基(500mL茄子瓶装斜面培养基100mL)，置于30℃恒温培养箱内培养3～5d，使栓菌菌丝长度达到5～10mm，即可作为斜面种子使用。

每L斜面培养基含有：土豆浸出汁20mL(取200g土豆去皮加入800mL水，煮沸0.5h，冷却后定容到1000mL)，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH为6.0。