[发明专利]一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法，属于生物分析和医学检测技术领域。

背景技术

蛋白聚糖(proteoglycan，PG)是一类复杂的生物大分子，在核心蛋白上共价偶联着一条或多条糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)链。GAG是由重复的二糖单位组成的直链多糖，主要分为四类：透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)及肝素(Hep)/硫酸乙酰肝素(HS)。其中透明质酸不与核心蛋白结合组成蛋白聚糖。蛋白聚糖除含糖胺聚糖链外，还偶联一些N-或O-链接的寡糖链。

PG在细胞外基质中广泛分布，也存在于细胞表面以及细胞内的分泌颗粒中。在机体中PG参与了众多生理学过程，如作为组织结构的构成原件存在，调控细胞的增殖、粘附、迁移和变异等过程，还参与生长因子、细胞因子的结合，细胞的信号转导，神经元的生长和形态发生等过程。在癌变微环境中，PG的表达显著改变，因此一部分蛋白聚糖被用作检测某些疾病的特异性标志分子，如蛋白聚糖Glypican的家族成员之一Glypican-3(GPC3)，目前被普遍认为是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的特异性标志分子。

GPC3由单链核心蛋白、硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate，HS)链和糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)组成，通过GPI锚定于细胞膜上。GPC3在75％的HCC中显著表达，但在肝脏正常组织和良性病变中并不表达，因此是比甲胎球蛋白更为特异和灵敏的新型HCC标志分子。

由于蛋白聚糖核心蛋白分子量的大小及其结构不同，且共价偶联的GAG链的数量、种类、长度、硫酸化程度及偶联部位不同，使得蛋白聚糖组成复杂，结构多样，因而给其检测带来了诸多困难。在GPC3的检测中，目前最常用的检测方法为夹心ELISA法，但其检测灵敏度偏低，只能检测到50％左右HCC病人血清中有明显GPC3存在；且由于第一抗体在酶标板上的吸附包被及第二抗体与抗原的结合需要孵育过夜，完成一次实验需要三天时间，耗时较长，这极大的限制了此方法的应用，给GPC3的检测带来了困难。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法。该试剂盒可运用耦联抗体的石墨烯与GPC3核心蛋白的结合，对结合在GPC3 HS侧链上的ScGFP的荧光淬灭作用达到对血清/血浆中HCC的标志物GPC3的高灵敏度快速检测。

一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：

偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；

带高正电荷的荧光蛋白；

缓冲液：含有浓度5～50mM Tris-HCl和浓度50～200mM NaCl的溶液。

根据本发明优选的，所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、Decorin、Lumican、Perleacan、Agrin、CD44或NG2；进一步优选的，所述的蛋白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2；最优的，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。

根据本发明优选的，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。

根据本发明优选的，所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。

根据本发明优选的，所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。

根据本发明优选的，所述偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。