[发明专利]一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：

偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；

带高正电荷的荧光蛋白；

缓冲液：含有浓度5～50 mM Tris-HCl和浓度50～200 mM NaCl的溶液；

所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、Decorin、Lumican、Perleacan、Agrin、CD44或NG2；

所述单克隆抗体1的制备方法如下：

（i）蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端50~90个氨基酸序列的表达基因插入pTracer真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.5～2.5mg/ml，制得抗原；

（ii）将步骤（i）制得的抗原免疫Balb/c小鼠3次，抗原免疫量为50～100 μg /次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；

（iii）向Balb/c小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤（ii）制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体1；

所述单克隆抗体2的制备方法如下：

（a）蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端490～530个氨基酸序列的表达基因插入pTracer真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.5～2.5mg/ml，制得抗原；

（b）将步骤（a）制得的抗原免疫Balb/c小鼠3次，抗原免疫量为50～100 μg /次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；

（c）向Balb/c小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤（b）制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体2；

所述多克隆抗体3的制备方法如下：

a、蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端290个氨基酸序列表达基因插入pTracer真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.0～2.0 mg/ml，制得抗原；

b、将步骤a制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400 μg /次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体3；

所述多克隆抗体4的制备方法如下：

A、蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端290个氨基酸序列表达基因插入pTracer真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.0～2.0 mg/ml，制得抗原；

B、将步骤A制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400 μg /次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体4。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为5～20 μg/mL。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为5～20 μg/mL。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为5～20 μg/mL。