[发明专利]一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法

说明书

本发明公开了一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法。先对MDBK细胞进行单克隆，然后接种两种生物型(致细胞病变型和非致细胞病变型)的牛病毒性腹泻/黏膜病毒，最后用间接免疫荧光技术测定病毒滴度，确定病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的为对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系。本发明筛选的MDBK细胞系对两种生物型的牛病毒性腹泻/黏膜病毒均敏感，可直接应用于牛病毒性腹泻/黏膜病疫苗的研究和生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法。

背景技术

牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻/黏膜病毒(bovine viraldiarrhea virus，BVDV)引起牛发生的一种传染病。其病原牛病毒性腹泻/黏膜病毒是黄病毒科瘟病毒属的成员，是一种单股RNA、有囊膜的病毒。根据是否可使培养细胞产生细胞病变，可将牛病毒性腹泻/黏膜病毒分为两种生物型：一种为病毒在细胞中复制不引起细胞病变，称为非致细胞病变型；另一种为病毒在细胞中复制引起细胞形成空泡、发生核固缩、溶解和死亡等病变，称为致细胞病变型。

牛病毒性腹泻/黏膜病毒感染奶牛后的临床表现主要为发热﹑腹泻、产奶量下降、胃肠炎、不同程度的牛病毒性腹泻/黏膜病，出现免疫抑制从而继发其它感染。母畜感染后可造成流产，产出死胎、畸形胎，在特定的妊娠阶段感染牛病毒性腹泻/黏膜病毒后可分娩出持续性感染牛。牛病毒性腹泻/黏膜病在全球范围内分布流行，是世界范围内流行的严重威胁养牛业的两种重大疾病，为世界动物卫生组织(Office International DesEpizooties，OIE)法定报告的动物疫病，我国进出口检疫中把其定为B类传染病。除给养牛业造成巨大经济损失外，因牛病毒性腹泻/黏膜病毒感染牛后可产生持续性感染，导致病牛机体免疫机能损害，甚至终身带毒、散毒，成为养牛业的“隐型炸弹”，严重威胁养牛业的安全。

国外针对牛病毒性腹泻/黏膜病病主要采取疫苗接种和淘汰持续感染病畜的综合防治措施。而国内由于起步较晚，对牛病毒性腹泻/黏膜病未引起足够重视，尚未有商品化的疫苗，导致目前该疾病全国范围内严重流行，急需开展相关疫苗研究，为我国防控并最终根除这种疾病提供安全有效的疫苗保障。目前，国内的牛病毒性腹泻病疫苗研究主要是利用MDBK(牛肾细胞)接种牛病毒性腹泻/黏膜病毒流行毒株的细胞培养物而产生的弱毒疫苗或者灭活疫苗。疫苗中病毒滴度的高低是疫苗免疫效果的决定性因素，因此，选育一株对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的细胞系，提高病毒滴度对牛病毒性腹泻/黏膜病疫苗的生产具有现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法。

为解决以上技术问题，本发明采取以下技术方案：一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，先对MDBK细胞进行单克隆，然后接种两种生物型(致细胞病变型和非致细胞病变型)的牛病毒性腹泻/黏膜病毒，最后用间接免疫荧光技术测定病毒滴度，病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的为对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系。其中：

对MDBK细胞进行单克隆包括以下步骤：用含10％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)胎牛血清的MEM培养基将无外源病毒污染的MDBK细胞培养至铺满细胞培养瓶瓶底，用0.25％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的胰蛋白酶液消化成单个散在细胞，用含10％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)胎牛血清的MEM培养基在96孔板培养单个散在细胞，标记只含有一个细胞的孔，待细胞数量增加后，再扩大培养，得到MDBK单克隆细胞。