[发明专利]一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法

权利要求书

1.一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，先对MDBK细胞进行单克隆，然后接种致细胞病变型和非致细胞病变型两种生物型的牛病毒性腹泻/黏膜病毒，最后用间接免疫荧光技术测定病毒滴度，确定病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的为对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系；

对MDBK细胞进行单克隆包括以下步骤：用含体积浓度10％胎牛血清的MEM培养基将无外源病毒污染的MDBK细胞培养至铺满细胞培养瓶瓶底，用质量体积浓度0.25％的胰蛋白酶液消化成单个散在细胞，用含体积浓度10％胎牛血清的MEM培养基在96孔板培养单个散在细胞，标记只含有一个细胞的孔，待细胞数量增加后，再扩大培养，得到MDBK单克隆细胞。

2.根据权利要求1所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，所述接种的两种生物型的牛病毒性腹泻/黏膜病毒为致细胞病变型BVDV1株和非致细胞病变型BVDV2株的混合毒液。

3.根据权利要求2所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，BVDV1株和BVDV2株各0.5mL，BVDV1株病毒毒价为10^5.0TCID₅₀/mL，BVDV2株病毒毒价为10^4.5TCID₅₀/mL，加入1.5mL EP管中混匀形成混合毒液。

4.根据权利要求3所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，MDBK单克隆细胞继续在培养箱培养至MDBK细胞生长覆盖率为85％-95％的单层后，接种BVDV1株和BVDV2株混合毒液。

5.根据权利要求4所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，所述混合毒液按10倍梯度稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，每个稀释度平行接种8孔，然后加入细胞培养板中，每孔50μL，吸附1h，然后补加含体积浓度2％胎牛血清的MEM培养基至200μL培养。

6.根据权利要求1至5任一项所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，细胞培养环境为37℃、5％CO₂。

7.根据权利要求1至5任一项所述的筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系的方法，其特征在于，间接免疫荧光技术测定病毒滴度的方法为：

固定：培养板上MDBK细胞接种两种生物型的牛病毒性腹泻/黏膜病毒后在37℃、5％CO₂培养箱中培养8-10h后，弃去培养基，用PBST液洗板，每孔加入150μL预冷丙酮，置于4℃冰箱固定15-20min；

抗体孵育：取出细胞培养板，弃去固定液，用PBST洗板，将BVDV单克隆抗体为一抗按照1:1000稀释后加入细胞培养板，每孔50μL，将细胞培养板置于湿盒中，37℃孵育1h，弃去一抗，用PBST洗板，将FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗按照1:2000稀释后，将培养板置于湿盒中，37℃孵育1h；

荧光观察：弃去标记抗体，用PBST洗板，置于荧光显微镜下观察荧光，细胞胞浆中显示特异性黄绿色荧光判定为阳性；

MDBK细胞对两种生物型的牛病毒性腹泻/黏膜病毒的敏感性鉴定：按照Reed-Muench方法计算显示阳性的板孔中病毒半数致死量TCID₅₀，将病毒滴度均高于10⁶TCID₅₀/mL的细胞确定为对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的MDBK细胞系。