[发明专利]一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法

说明书

本发明涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：按照多个基因的相对表达量将相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；构建标准品竞争性模板和待测样品竞争性模板，进行三轮多重竞争性PCR反应；混合第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并分析，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。本发明基于高速发展的二代测序平台，准确快速定量目标模板和内参照模板，并可以同时对多个样本进行5个目的基因表达差异分析，流程简单易行，价格低廉；当需要分析多样本间多基因表达差异时，不失为一种具有高准确度，通量适中，成本廉价的方法。

技术领域

本发明属于基因表达分析技术领域，特别涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法。

背景技术

在后基因组学时代，基因组学研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。研究者们通过分析基因表达水平,可从中获取基因转录基因调控信号转导通路核酸和蛋白质结构功能及其相互联系等相关信息；揭示基因在时间、空间上的表达及调控模式，为研究基因功能，阐释复杂性状提供新的方法。

分析目的基因表达量的常用技术有如下几种：传统的Northern blot分析和核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay)灵敏度低，过程繁琐，通量低(Parker,R.M.&Barnes,N.M.(1999)Methods Mol.Biol.106,247-283&Hod,Y.(1992)BioTechniques13,852–854)；基因芯片表达谱(DNA chip)具有高通量的优势，但难以避免高成本，重复性较差的缺点；通常来说，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)和竞争性PCR(competitive PCR)被认定为灵敏度最高的定量PCR方法(Livak,K.J.,Flood,S.J.,Marmaro,J.,Giusti,W.&Deetz,K.(1995)PCR Methods Appl.4,357-362&Becker-Andre,M.&Hahlbrock,K.(1989)Nucleic Acids Res.17,9437–9446)。

然而，在面对大量样本时，Real-time PCR的实验成本让许多研究者难以接受；另一个短处是Real-time PCR很难矫正在扩增期间管与管的差异，从而影响最终稳定性(Siebert,P.D.&Larrick,J.W.(1992)Nature 359,557-558)。竞争性PCR利用目标模板与内参照模板共用同一对引物的特点,实现了同引物在同条件下的竞争性扩增，有着更高的稳定性和低廉的价格(Lorena Zentilin,Mauro Giacca(2007)NATURE PROTOCOLS 2,2092-2104)。但是目前的竞争性PCR也存在一些弊端：利用琼脂糖凝胶电泳定量产物时面临动态检测范围低，通量低，稳定性差的问题(Bustin,S.A.(2000)J.Mol.Endocrinol.25,169-193)；利用质谱定量则要引进单碱基延伸反应(base extension reaction)，增加了实验成本，并且多基因产物均一性不好，对于低丰度的基因分辨率低(Chunming Ding,CharlesR.Cantor(2003)PNAS.100,3059–3064)。