[发明专利]一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，包括：

(1)引物分组：按照多个基因的相对表达量将基因相应的特异性PCR引物分为高表达基因和低表达基因两组，并在组内调整特异性PCR引物浓度比例；其中，多个基因包括看家基因和目标基因；每个基因的相对表达量是通过Real-Time PCR检测，根据每个基因Ct值的高低将特异性PCR引物分为两组；调整引物浓度为将高表达基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4倍，引物浓度比例满足多个基因产物均一性为差异在35倍以内；

特异性PCR引物的设计方法为：针对基因cDNA序列，利用Primer3在线软件进行设计，并在上下游引物5’端分别添加上下游通用序列，进而合成获得特异性PCR引物；

(2)竞争性模板构建和待测样本准备：针对每个基因分别设计一条特异性逆转录引物A和一条特异性逆转录引物B，利用特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B以标准品RNA为模板分别进行多重逆转录反应，构建标准品A、B竞争性模板；利用特异性逆转录引物B以待测样品RNA为模板进行B组多重逆转录反应，构建待测样品B竞争性模板；

其中，特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B的设计方法为：参照每个基因的cDNA序列，将特异性PCR引物的上游引物的3’端延伸14个碱基，分别在延伸部位的第3、4位进行碱基颠换突变，并去掉特异性PCR引物中的通用序列，由此获得特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B，逆转录反应后得到两种单碱基差异的cDNA；

(3)三轮多重竞争性PCR：利用步骤(2)中的标准品A、B竞争性模板和待测样品B竞争性模板进行三轮多重竞争性PCR；三轮多重竞争性PCR包括：

①将标准品A、B竞争性模板按体积梯度比例混合，将待测样品B竞争性模板与标准品A竞争性模板等体积混合，作为第一轮多重竞争性PCR模板，分别混入低表达基因对应的特异性PCR引物，进行第一轮多重竞争性PCR反应；

②将第一轮多重竞争性PCR反应得到的第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮的模板，混入高表达基因对应的特异性PCR引物，进行第二轮多重竞争性PCR反应；

③将第二轮多重竞争性PCR产物稀释作为模板，加入接头引物，进行第三轮多重竞争性PCR反应；其中，接头引物包含三部分序列，从5’端开始依次是二代测序接头引物、条形码序列、通用序列；

(4)等体积混合所有步骤(3)中得到的第三轮反应产物作为二代测序平台文库上机测序，提取数据并计算测定序列数，根据标准品梯度比例数据绘制标准曲线，校准待测样本数据，将看家基因归一化处理后，即得到不同样本间多个基因相对表达量差异。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中多个基因为8个基因，包括5个目的基因和3个看家基因。

3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，其特征在于，所述梯度比例为2μL：16μL，6μL：12μL，9μL：9μL，12μL：6μL，16μL：2μL。

4.一种如权利要求1所述的非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法的应用，其特征在于，应用于基因表达分析实验中。