[发明专利]一种制备阿魏酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及阿魏酸的制备方法，涉及一种利用黑曲霉固态发酵产酶酶法制备阿魏酸的方法，尤其涉及使用一株黑曲霉AspergillusnigerTRIIM3.00954发酵提取酶液在酶解去淀粉玉米麸皮过程中破坏细胞壁结构制备阿魏酸的方法。

背景技术

阿魏酸（Ferulicacid,FA），化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸（4-hydroxy-3-methoxycinnamicacid），其分子式为C₁₀H₁₀O₄，熔点169-173℃，溶于热水、乙醇乙酸乙酯，微溶于苯和石油醚。具有顺式、反式两种异构体，顺式异构体为黄色油状物质，反式异构体为斜方针状结构。阿魏酸是普遍存在于植物界的一种酚酸，为当归、大三叶升麻、川芎等中药材的重要有效成分。阿魏酸有抗氧化、降血脂、抗突变和防癌等功能，已广泛应用于医药、食品、化妆品等行业，因此具有广泛的应用价值和发展前景。

自然界中，阿魏酸以酯键和醚键分别与细胞壁多糖及木质素相连接，在植物细胞壁间形成了致密网状结构，从空间上阻碍了纤维素酶和半纤维素的降解作用。阿魏酸酯酶（feruloylesterase，EC.3.1.1.73，FAE），属于羧基酸酯酶(E.C.3.1.1.1)的一个亚纲，其对于打断酯键交联，破坏细胞壁骨架结构，释放反式阿魏酸具有重要作用。目前，工业上以化学合成法或植物提取法制备阿魏酸，但因其耗时长、成本高、产量低，使得当前国际市场价格居高不下，售价约每千克170美元。因此，积极利用阿魏酸酯酶从农林废弃物中制备阿魏酸具有十分重要的意义。随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成等方法相比，生物酶法制备阿魏酸具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种制备阿魏酸的方法，具有条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单等优点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种制备阿魏酸的方法，以农林废弃物麦麸、甘蔗渣为固态发酵培养基，以黑曲霉TRIIM3.00954为发酵产酶菌株，以去淀粉麦麸为酶解底物，进行生物酶解制得阿魏酸。

所述的制备阿魏酸的方法，步骤如下：

1）将黑曲霉TRIIM3.00954接种到PDA固体培养基上，在28℃条件下，静置培养5-7d，得到成熟的斜面培养物；

2）用得到的斜面培养物，接种到PDA液体培养基中，在28℃条件下，180rpm振荡培养2d，制得种子培养液；

3）使用种子培养液，按每瓶接种1mL孢子悬浮液接种到固态发酵培养基中，摇匀后置30℃条件下静置培养；

4）使用固态发酵培养物，加入培养基干重12倍的0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在37℃条件下，150rpm振荡浸提50min，过滤收集浸提液，离心分离后获得的上清液即为粗酶液；

5）使用粗酶液，加入木聚糖酶、pH6.5的缓冲液以及去淀粉麦麸，在50℃的条件下，180rpm振荡酶解，一定时间后酶解液取样得到阿魏酸酶解液。

步骤（3）中，固态发酵培养时间为7d。

步骤（5）中，加酶量分别为阿魏酸酯酶0.6U/g、木聚糖酶90U/g，酶解体系固液比为1：30，酶解时间为6h。

步骤（4）中，粗酶液阿魏酸酯酶（FAE）酶活定义为在40℃、pH6.0条件下，水解底物阿魏酸甲酯每分钟产生1μmol阿魏酸所需酶量为1个酶活力单位（U）。酶解底物为一级色谱纯甲醇溶解的50mM阿魏酸甲酯。取800μL0.1MpH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入100μL阿魏酸甲酯甲醇溶液，置于40℃预热5min，加入上述制备的100μL酶液。将混合物于40℃下反应30min后，沸水灭活10min终止反应，室温冷却。根据Andersen^[15]改进的高效液相色谱法在320nm下测定阿魏酸生成量。色谱柱型号为ZORBAXEclipsePlusC18。色谱条件为：流动相为甲醇：0.1%乙酸(35:65)，流速为0.8mL/min，柱温30℃，进样量5μL，检测波长为320nm。同时，以灭活酶液作对照。