[发明专利]利用优化的基因密码子扩展系统通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白

说明书

本发明涉及利用基因密码扩展的非天然氨基酸系统，高效率通读单基因遗传病中致病基因的无义突变位点，恢复突变体蛋白的正常结构和功能。通过改造古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)，得到全新的高通读效率的UAA和UGA编码的非天然氨基酸系统，扩展了tRNAPyl和吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶(PylRS)正交对的使用范围。构建了模拟内源性提前终止密码子的质粒——在由内含子和外显子组成的Smad基因上引入提前终止密码子，可以用于评价通读内源性提前终止密码子的效率。发明中涉及无义突变的系统主要包括单基因遗传病的致病基因和肿瘤细胞内的肿瘤抑制基因。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及利用基因密码扩展的非天然氨基 酸系统，通读单基因遗传病的无义突变位点。并且通过改造古甲烷球菌的 tRNA(tRNAPyl)，得到全新的高通读效率的UAA和UGA编码的非天然氨 基酸系统，扩展了tRNAPyl和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)正交对的 使用范围，可用于通读三种无义突变的终止密码子UAG，UAA和UGA。

背景技术

无义突变导致的遗传性疾病

人类基因组中的存在许多种基因突变类型，无义突变是基因突变中的 一类。基因突变是基因组DNA分子发生的可遗传的变异现象，其中包括移码 突变和碱基置换。移码突变包括碱基的插入和缺失，碱基置换主要为错义突 变和无义突变。无义突变是指编码基因的某个碱基发生突变，产生终止密码 子UAG、UAA和UGA，终止密码子不编码任何氨基酸。终止密码子不能与转 移RNA(tRNA)的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽键的合成，使蛋白质合成终止，因而生成不完整和没有功能的蛋白质。无 义突变的发生使基因框内产生提前终止密码子(Premature termination codons， PTC)，导致基因编码的两种结果，一种即产生截短型蛋白，另一种则导致含 有PTC的mRNA的稳定性降低，从而引发无义介导的mRNA降解途径(NMD)。 据统计，大约有11.2％的遗传性疾病会产生PTC突变，被称作提前终止密码子 病(Premature termination codons diseases，PTC diseases)，另一方面，许多癌症发 生也会产生PTC突变(KEELING K.M.，WANG D.，CONARD S.E.，BEDWELL D.M..Suppression of premature termination codons as a therapeuticapproach.Critical reviews in biochemistry and molecular biology，2012，47: 444-463.)。

杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)是PTC疾病中 的一个典型代表。DMD是一种严重的肌肉萎缩疾病，也是最常见的X连锁 隐性遗传性疾病，以进展性、致死性为主要特点。DMD基因的无义突变则是 导致DMD发生的主要原因之一。无义突变产生提前终止密码子UAG、UAA、 UGA，生成截短了的多肽产物，使患者缺失或缺少功能性的抗萎缩蛋白 (dystrophin)，致使肌肉萎缩。据报道，Duchenne型肌营养不良症在活产男 婴中的发病率为1/6300～1/3500[Dooley J，Gordon KE，Dodds L， MacSween J.Duchenne musculardystrophy:a 30-year population-based incidence study.Clin Pediatr(Phila)，2010，49:177-179.]。该病目前尚无有 效治愈方法，多于幼年期发病，青少年期丧失行走能力，成年早期死亡，给 患者个人、家庭和社会造成沉重心理和经济负担。