[发明专利]抑制性tRNA通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白

说明书

本发明涉及利用构建抑制性tRNA延长致病基因无义突变体的截短蛋白，使哺乳动物细胞中产生全长有功能的蛋白，从而恢复突变体的正常结构和功能。发明中涉及无义突变的体系包括单基因遗传病的致病基因和肿瘤细胞内的肿瘤抑制基因。本发明主要涉及构筑对应三种终止密码子的19种抑制性tRNA，在哺乳动物细胞中高效通读dystrophin蛋白，并在肿瘤细胞通读无义突变蛋白，作用显著。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及利用构建抑制性tRNA延长致病基因无义突变体的截短蛋白，使哺乳动物细胞中产生全长有功能的蛋白，从而恢复突变体的正常结构和功能。本发明主要涉及构筑对应三种终止密码子的19种抑制性tRNA，在哺乳动物细胞中通读dystrophin蛋白并在肿瘤细胞通读无义突变蛋白，作用显著。

背景技术

无义突变及其引起的遗传性疾病

人类基因组中的存在许多种基因突变类型，无义突变是基因突变中的一类。基因突变是基因组DNA分子发生的可遗传的变异现象，其中包括移码突变和碱基置换。移码突变包括碱基的插入和缺失，碱基置换主要为错义突变和无义突变。无义突变是指编码基因的某个碱基发生突变，产生终止密码子UAG、UAA和UGA，终止密码子不编码任何氨基酸。终止密码子不能与转移RNA(tRNA)的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽键的合成，使蛋白质合成终止，因而生成不完整和没有功能的蛋白质。无义突变的发生使基因框内产生提前终止密码子(Premature termination codons，PTC)，导致基因编码的两种结果，一种即产生截短型蛋白，另一种则导致含有PTC的mRNA的稳定性降低，从而引发相应的遗传性疾病。据统计，大约有11.2％的单基因遗传性疾病会产生PTC突变，被称作提前终止密码子病(Premature termination codons diseases，PTC diseases)，另一方面，许多癌症发生也会产生PTC突变(KEELING K.M.et al.Critical reviews in biochemistry andmolecular biology，2012，47：444-463.)。

杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)是PTC疾病中的一个典型代表。DMD是一种严重的肌肉萎缩疾病，也是最常见的X连锁隐性遗传性疾病，以进展性、致死性为主要特点。DMD基因的无义突变则是导致DMD发生的主要原因之一。无义突变产生提前终止密码子UAG、UAA、UGA，生成截短了的多肽产物，使患者缺失或缺少功能性的抗萎缩蛋白(dystrophin)，致使肌肉萎缩。据报道，Duchenne型肌营养不良症在活产男婴中的发病率为1/6300～1/3500[Dooley J.et al.Clin Pediatr(Phila)，2010，49：177-179.]。该病目前尚无有效治愈方法，多于幼年期发病，青少年期丧失行走能力，成年早期死亡，给患者个人、家庭和社会造成沉重心理和经济负担

抑制性tRNA通读无义突变

人类基因组中的61种密码子可以被tRNA识别，编码20种氨基酸，三种终止密码子(UAG、UAA、UGA)没有相应的tRNA识别，不编码氨基酸，进而终止翻译。但是有研究发现，存在可以识别终止密码子的tRNA，使终止密码子编码氨基酸，蛋白翻译正常进行。这种能够识别终止密码子的tRNA，即为无义突变抑制性tRNA。抑制性tRNA存在广泛，无论在植物细胞还是动物细胞中，都发现了抑制性tRNA。但由于抑制性tRNA在细胞中含量极少，因此抑制性tRNA不易被检测到。